用于鉴别检测非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体公开了用于鉴别检测非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法。本发明专利技术用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR的引物探针组合，其含有两对特异性引物和两条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别检测非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体地说，涉及用于鉴别检测非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是引起猪的一种急性、高度接触性传染病病原。该病传播迅速，病死率达100％，给养猪业造成巨大经济损失。因尚无预防ASF的疫苗和治疗措施，所以及时诊断成为预防疫病的关键。
[0003]随着非洲猪瘟疫病流行态势的变化，当前非洲猪瘟病毒流行毒株仍以基因Ⅱ型病毒为主，但与原非洲猪瘟毒株相比，出现了非洲猪瘟病毒变异株，包括基因缺失株、自然变异株、自然弱毒株等，在已经报道的自然弱毒株和构建的基因缺失株当中，研究较多的有CD2v、MGF、I177L等基因缺失株。例如，哈尔滨兽医研究所在研的ASFV 7基因缺失减毒活疫苗(ASFV
‑
7GD)有I177L基因的缺失；中国农业科学院兰州兽医研究所专利技术专利“缺失十个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用”中，敲除了I177L基因的334～422位片段；宋庆庆等人构建的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒毒株，I177L基因缺失了第337
‑
447位片段；美国D
·
P
·
格拉德等人(基于基因I177L缺失的新型非洲猪瘟减毒活疫苗的开发:CN202080073072.2[P].2022
‑
05
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27)提供了关于构建用于预防由重组ASFV的各种病毒株引起ASF的重组非洲猪瘟病毒(ASFV)减毒活疫苗的细节，示例性疫苗包含ASFV
‑
GΔI177l修饰的病毒，其中I177L基因第334～450位缺失。为此，建立针对非洲猪瘟I177L基因缺失毒株特异性的鉴别检测方法，为非洲猪瘟疫苗研发和疫病防控提供技术支撑，具有十分必要的现实意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可实现定性和定量检测鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法。
[0005]为了实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：
[0006]第一方面，本专利技术提供用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR的引物探针组合，其含有两对特异性引物和两条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1
‑
2和SEQ ID NO.13
‑
14所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15所示。
[0007]具体地，该引物探针组合包括：用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的上游引物(p72
‑
F1)和下游引物(p72
‑
R1)，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如SED ID NO.1～2所示；用于对非洲猪瘟病毒p72基因检测的TaqMan探针(p72
‑
P1)，所述TaqMan探针的核苷酸序列如SED ID NO.3所示；
[0008]用于特异性检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株缺失的334～450位核苷酸的上游
引物(I177L
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F2)和下游引物(I177L
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R2)，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如SED ID NO.13～14所示；用于对非洲猪瘟病毒I177L基因缺失区域检测的TaqMan探针(I177L
‑
P2)，所述TaqMan探针的核苷酸序列如SED ID NO.15所示。
[0009]本专利技术的I177L
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F2和I177L
‑
R2所针对的检测靶标为I177L基因特定缺失的片段，该特定片段短小，本专利技术经不断摸索变化引物探针所针对的位置(以检测目标为中心，向前或向后移动几个或十几个碱基位置进行摸索设计)，经多次筛选后才获得了具理想检测效果的引物探针组合。
[0010]本专利技术的引物探针组合中，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团并在3
’
端经磷酸化处理，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；
[0011]所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL中的任一种。
[0012]优选，所述特异性探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。进一步优选，序列如SEQ ID NO.3所示的特异性探针的5
’
端标记FAM荧光报告基团，3
’
端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.15所示的特异性探针的5
’
端标记HEX荧光报告基团，3
’
端标记BHQ1荧光淬灭基团。
[0013]第二方面，本专利技术提供上述引物探针组合在制备用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂或试剂盒中的应用。
[0014]第三方面，本专利技术提供用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其包含上述的引物探针组合。
[0015]本专利技术的双重荧光定量PCR检测试剂盒中，所述双重荧光定量PCR检测试剂盒在进行检测时，每25μL荧光定量PCR检测体系中包括：0.5μL浓度为10μM的p72
‑
F1，0.5μL浓度为10μM的p72
‑
R1，0.5μL浓度为10μM的p72
‑
P1，0.75μL浓度为10μM的I177L
‑
F2，0.75μL浓度为10μM的I177L
‑
R2，0.75μL浓度为10μM的I177L
‑
P2；p72
‑
F1、p72
‑
R1和p72
‑
P1的序列分别如SEQ ID NO.1
‑
3所示，I177L
‑
F2、I177L
‑
R2、I177L
‑
P2的序列分别如SEQ ID NO.13
‑
15所示。
[0016]本专利技术的双重荧光定量PCR检测试剂盒中，每25μL荧光定量PCR检测体系中还包括：12.5μL的预混液HieffUniversal TaqMan multiplex qPCR master mix；
[0017]和/或，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的重组质粒，所述阴性对照为不含非洲猪瘟病毒及基因组的组分，如DEPC处理水(双蒸水、去离子水等)；
[0018]和/或，还包括标准品，所述标准品为含相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR的引物探针组合，其特征在于，含有两对特异性引物和两条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1
‑
2和SEQ ID NO.13
‑
14所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团并在3
’
端经磷酸化处理，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL中的任一种。3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂或试剂盒中的应用。4.用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物探针组合。5.根据权利要求4所述的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述双重荧光定量PCR检测试剂盒在进行检测时，每25μL荧光定量PCR检测体系中包括：0.5μL浓度为10μM的p72
‑
F1，0.5μL浓度为10μM的p72
‑
R1，0.5μL浓度为10μM的p72
‑
P1，0.75μL浓度为10μM的I177L
‑
F2，0.75μL浓度为10μM的I177L
‑
R2，0.75μL浓度为10μM的I177L
‑
P2；p72
‑
F1、p72
‑
R1和p72
‑
P1的序列分别如SEQ ID NO.1
‑
3所示，I177L
‑
F2、I177L
‑
R2、I177L
‑
P2的序列分别如SEQ ID NO.13
‑
15所示。6.根据权利要求5所述的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，每25μL荧光定量PCR检测体系中还包括：12.5μL的预混液Hieff Universal TaqMan multiplex qPCR master mix；和/或，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的重组质粒，所述阴性对照为不含非洲猪瘟病毒及基因组的组分；和/或，还包括标准品，所述标准品为含相同拷贝数的p72和I177L基因重组质粒混合液，浓度选自1
×
10
10
、1
×
109、1
×
108、1
×
107或1
×
106copies/μL。7.一种非疾病诊断目的利用双重荧光定量PCR技术鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的方法，其特征在于，以待测样品的DNA为检测模板，利用如SEQ ID NO.1
‑
2和SEQ ID NO.13
‑
14所示的特异性引物和如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15所示的特异性探针进行双重荧光定量PCR检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有相应病毒，和/或根据标准曲线得出待测样品中相应病毒的含量。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽媛，刘建奇，李劼，陈鸿军，宋庆庆，刘英楠，邬彩丽，谢振华，刘静宜，狄栋栋，武瑾贤，王毛毛，
申请(专利权)人：内蒙古金宇生物疫苗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：