重组人源化III型胶原蛋白、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种重组人源化III型胶原蛋白、制备方法及其应用。所述的重组人源化III型胶原蛋白含有480个氨基酸，理论分子量约44kd，构建的毕赤酵母基因工程菌能够有效稳定和大量地表达重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。本发明专利技术的重组人源化胶原蛋白富含多个整合素结合基序，具有良好的亲水性，与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，并且具有较好促细胞黏附、增殖和迁移的活性，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。具有潜在的应用前景。具有潜在的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
重组人源化III型胶原蛋白、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种重组人源化III型胶原蛋白、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是细胞外基质(ECM)中含量最丰富的蛋白家族，约占蛋白总量的25～30％，发挥传递生长因子和细胞因子、维持组织结构完整性、影响细胞黏附和增殖等多种生物学功能。胶原蛋白具有其他合成材料无法比拟的生物相容性、生物可降解性及可规模化生产等优点，它不仅可作为保健食品、美容产品、包装材料，还可以作为食品添加剂应用，是继透明质酸后又一应用领域横跨医疗、医美、化妆品、食品的成分。
[0003]目前胶原蛋白的生产方法主要有传统提取法、化学合成法和生物合成技术法。提取自动物的皮肤和跟腱等组织的传统胶原蛋白，其原料来源广泛，但存在病毒隐患、纯度低、免疫反应等缺点。化学合成法无法实现批量制备，且制备成本较高。生物合成技术是利用基因工程技术实现重组胶原蛋白的表达，其具有成本低、效率高等优点，且能够通过菌种发酵技术实现大规模工业生产，具有很好的应用前景。其中毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统既具有原核表达系统易于培养、繁殖快速、表达量高的优点，又具有真核表达系统外源蛋白翻译后再加工修饰等特点，目前已有超过500种外源蛋白在毕赤酵母中获得成功表达。在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可实现细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，便于纯化。
[0004]整合素是细胞粘附分子的一大家族，是广泛分布于细胞表面的粘附受体，它参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用，介导细胞的增殖、分化、粘附、迁移等过程。胶原蛋白可以与整合素、盘状蛋白结构域等多种细胞表面受体结合，调控细胞的各项生命活动。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种重组人源化III型胶原蛋白、制备方法及其应用。该重组人源化III型胶原蛋白富含多个整合素结合基序(GER、GEK及RGD)，具有优异的亲水性。
[0006]本专利技术所述的重组人源化III型胶原蛋白，含有480个氨基酸，理论分子量约44kd，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0007]本专利技术还提供上述重组人源化III型胶原蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0008]进一步地，本专利技术提供表达上述重组人源化III型胶原蛋白的毕赤酵母基因工程菌，通过以下步骤构建：
[0009]PCR扩增重组人源化III型胶原蛋白的编码基因，纯化后，利用Gibson assembly技术无缝克隆到pPIC9K质粒的α因子分泌信号肽下游，经PCR和DNA测序验证正确后提取质粒，用SalI酶切线性化后电转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，经1～6g/L G418抗性梯度影印平板筛选获得表达重组人源化III型胶原蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌。
[0010]优选地，PCR扩增重组人源化III型胶原蛋白的编码基因采用的引物为：SEQ ID NO.7所示的引物1：CTGAAGCTTACGTAGAATTC和SEQ ID NO.8所示的引物2：GCGAATTAATTCGCGGCCGC。
[0011]更进一步地，本专利技术提供上述重组人源化III型胶原蛋白在制备生物医用材料或化妆品中的应用。
[0012]本专利技术从已知序列的人体Ⅲ型α1链胶原蛋白氨基酸序列筛选出水溶性强且富含多个整合素结合基序的氨基酸序列，并以该氨基酸序列为重复单元经8次重复后形成的片段作为优选片段，根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的重组人源化III型胶原蛋白
(m＝8)
的编码基因，将其插入毕赤酵母表达质粒中，转化、筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经发酵及纯化，得到高纯度的重组人源化III型胶原蛋白。本专利技术的重组人源化III型胶原蛋白
(m＝8)
的促细胞黏附、增殖和迁移性能均明显优于其他重复次数构建的重组人源化III型胶原蛋白(m＝6或10)，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
[0013]图1为人Ⅲ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性评价图。
[0014]图2为重组人源化III型胶原蛋白
(m＝8)
的氨基酸疏水性评价图。
[0015]图3为重组人源化III型胶原蛋白
(m＝8)
表达质粒构建图。
[0016]图4为重组人源化III型胶原蛋白
(m＝8)
的SDS
‑
PAGE结果图。
[0017]图5为各重组人源化III型胶原蛋白的细胞增殖图。
[0018]图6为各重组人源化III型胶原蛋白的细胞黏附图。
[0019]图7为各重组人源化III型胶原蛋白的细胞迁移图。
具体实施方式
[0020]下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。
[0021]实施例1
[0022]1.重组人源化III型胶原蛋白的设计
[0023]对人Ⅲ型α1链胶原蛋白氨基酸序列(SEQ ID No.1)进行疏水性分析，氨基酸评价结果如图1，疏水性评价分值越低其亲水性越好。为得到水溶性较好的胶原蛋白，根据疏水性分析结果，选择氨基酸评分较低的蛋白片段，同时选择富含整合素结合基序(GER、GEK及RGD)的区域，将选择的两个氨基酸序列片段整合(SEQ ID No.2)。以整合后的片段作为最小重复单元，对其多次重复，重复次数为m，设计m＝6(SEQ ID No.3)、8(SEQ ID No.4)或10(SEQ ID No.5)，获得三个重组人源化III型胶原蛋白。对三个重组人源化III型胶原蛋白的
氨基酸进行疏水性分析，所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该三个重组人源化III型胶原蛋白的亲水性均较好。以m＝8的重组人源化III型胶原蛋白为例，其氨基酸疏水性评价如图2所示。
[0024]2.表达重组人源化III型胶原蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌的构建
[0025](1)以m＝8的重组人源化III型胶原蛋白为例，将其氨基酸序列以毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的重组人源化III型胶原蛋白
(m＝8)
的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0026](2)利用引物1：CTGAAGCTTACGTAGAATTC(SEQ ID NO.7)和引物2：GCGAATTAATTCGCGGCCGC(SEQ ID NO.8)，PCR扩增重组人源化III型胶原蛋白
(m＝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组人源化III型胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。2.如权利要求1所述的重组人源化III型胶原蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。3.表达如权利要求1所述的重组人源化III型胶原蛋白的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，通过以下步骤构建：PCR扩增重组人源化III型胶原蛋白的编码基因，纯化后，利用Gibson assembly技术无缝克隆到pPIC9K质粒的α因子分泌信号肽下游，经PCR和DNA测序验证正确后提取质粒，用SalI酶切线性化后电...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨涛，李艳徽，
申请(专利权)人：广州易和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：