马兜铃酸D的对照品的制备方法技术

本发明专利技术提供马兜铃酸D的对照品的制备方法，包括酸碱前处理工序、特定的聚酰胺柱层析工序以及正相和反相色谱柱提纯工序等，通过特定的前处理，有效提升了提取分离效率，能够高通量的获得HPLC纯度高的目标物对照品。另外，本发明专利技术获得的马兜铃酸D的固体对照品的制备方法，工业生产适用性非常好。工业生产适用性非常好。工业生产适用性非常好。

【技术实现步骤摘要】
马兜铃酸D的对照品的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种马兜铃酸D的制备方法，尤其涉及能够制备可以用于适用于工业化的马兜铃酸D的固体对照品的制备方法。

技术介绍

[0002]马兜铃酸类成分是一类硝基菲类羧酸，具有肾脏毒性和致癌性。已报道的大量马兜铃酸肾病病例中，有些马兜铃酸肾病患者后续发生尿路上皮癌和膀胱癌。泌尿系统致癌性的发现使马兜铃酸被列为Ⅰ类致癌物。马兜铃酸类成分是一类植物次生代谢产物，广泛存在于马兜铃科植物中。马兜铃科植物共有500多种，在亚洲地区被作为传统药物用于治疗多种疾病。中国地区的马兜铃科植物主要有4属共70余种，其中大多数是药用植物，常作为中药材配伍使用，具有止咳平喘、祛风止痛和清热活血等功效。现在存于2020版药典中的马兜铃科植物仅有细辛一种，细辛临床应用广泛，主要用于治疗过敏性哮喘、鼻炎、咳嗽以及新型冠状病毒感染等症。除了入汤剂外，大量的中成药制剂中亦含有细辛。《中国药典》收载有50种含细辛品种。很多品种极为常用，如小青龙颗粒、儿童清肺口服液、小儿咳喘颗粒、痧气体丸、鼻渊舒口服液、小儿肺闭宁片、辛芩颗粒、九味羌活片、川芎茶调片、鼻炎片、胃炎宁冲剂、人参再造丸、正天丸、杜仲壮骨丸等，其中不乏儿童常用药。在含马兜铃、土木香、木通、防己、寻骨风等药材的中成药中均检测到了马兜铃酸成份。为了避免药物中的马兜铃酸类成分在实际应用中带来的毒性伤害，对马兜铃酸毒性进行早期诊断，对于其安全性监测极为重要。
[0003]常见的马兜铃酸类成分有马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D。目前国内外马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C的相关研究很多，马兜铃酸D的研究报道很少，市场上也很少有现成的马兜铃酸D供应。然而，马兜铃酸D(Aristolochic acid D)已经被列为《中华人民共和国药典》规定的毒性药材指标成分，其重要程度不容忽视。
[0004][0005]马兜铃酸D，分子式:C17H11NO8
[0006]由于马兜铃酸D已被药典列为药典毒性指标成分，所以分离得到马兜铃酸D标准品能够极大的提高相关药材质量控制水平，显得十分必要，具有极高应用价值。
[0007]马兜铃酸D检测方面的专利文献较多，但是大量提取工艺方面的文献很少，大部分
都是分离马兜铃酸D类似物。有文献报导通过醇提
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碱溶酸沉
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大孔树脂纯化
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高压制备的方法，从关木通中分离获得马兜铃酸Ⅰ和II，纯度分别为96％和94.45％，没有得率数据。还有文献报导将马兜铃药材进行醇提，醇提物与硅胶拌样，烘干后依次用石油醚，氯仿，乙醇索氏提取，氯仿提取物经硅胶柱层析，重结晶获得马兜铃酸，从其它溶剂提取物中分离获得另外2中马兜铃酸类似物，未做结构鉴定，也没有纯度和得率数据。还有文献报导，通过醇提
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浓缩析出
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沉淀经酒精多次洗涤
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硅胶柱层析
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重结晶的方法，从朱砂莲中分离获得马兜铃酸，得率0.45％，没有纯度数据。
[0008]专利文献
[0009][1]一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法CN113252810 A
[0010]非专利文献
[0011][1]屈碧琼，刘洁，阳娇，杨晓芹，潘绮雪，刘明妍，刘璐璐，肖红斌.马兜铃酸Ⅰ，II的制备工艺研究[J].华西药学杂志，2022,37(3)：245
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248.
[0012][2]李舒养，姚琪.广西马兜中马兜铃酸的分离与鉴定[J].中国药学杂质，1981,(02)：15
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18.
[0013][3]邱运平，陈秀珍，全德健，文玲芳，巫燕妹.朱砂莲化学成分的研究Ⅰ，马兜铃酸的分离[J].广西植物，1980,(01)：24
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27.
[0014]现状是植物来源的马兜铃酸D的植物来源的提取分离困难，没有现成的工艺，其总含量低，难以从混合物中结晶出来，因此已经公开的马兜铃酸D的现有提取制备方法非常有限，目前尚无高效的相关的马兜铃酸D工业化提取制备方法。作为一种重要的特征性成分，迫切需要研发一种高通量、能提供高纯度的纯度马兜铃酸D，且适合大量制备的马兜铃酸D对照品制备方法。

技术实现思路

[0015]本专利技术的目的在于提供一种高通量、能提供高纯度的纯度马兜铃酸D，且适合大量制备的马兜铃酸D对照品制备方法。本专利技术中，马兜铃酸D有时也称为分离目标物。本专利技术对马兜铃酸D的分离纯化做了很大的改进，引入了独特的pH调节手段，使整个提取方法适合于天仙藤药材化学成分的提取，再经过深入探索，找到了成本可控的提取分离手段，实现可以工业化的目标化合物提纯方法，在化合物的量和纯度上有了很大的提高，从而完成了本专利技术。
[0016]本专利技术通过简单高效的操作流程，能够分离得到纯度很高的马兜铃酸D。
[0017]本专利技术的制备分离方法依次包括以下步骤：
[0018]酸碱处理工序，将天仙藤药材总提取物粉末或浸膏，以3～7倍重量的pH值8～9的碱化的水溶液混悬，静置0.5～1.5小时后，以再以0.8～4倍体积的有机溶剂萃取，回收水相，加入酸性水溶液，调节pH至3～4，用0.8～4倍体积的体积有机溶剂萃取，回收有机相，浓缩得到天仙藤总提取物II，
[0019]聚酰胺纯化工序，将天仙藤总提取物II上样于100～200目聚酰胺柱层析，以乙酸乙酯：甲醇＝20:1～10:1洗脱液逐渐增加极性进行洗脱，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，天仙藤粗提物I，其中，甲醇中含有8体积％～12体积％的甲酸以及8体积％～12体积％的水；
[0020]反相色谱纯化工序：天仙藤粗提物I上样至反相色谱柱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.7:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液在50℃以下的温度减压浓缩，干燥得到马兜铃酸D的粗品II溶液，乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂中可选地含有0.1％～0.3％乙酸；
[0021]溶剂处理工序，将反相色谱纯化工序中所得到马兜铃酸D的粗品II溶液在50℃以下的温度浓缩，得到析出物，淋洗，干燥之后获得马兜铃酸D的对照品。
[0022]溶剂处理工序所得的马兜铃酸D的对照品，可以利用重结晶方法进行纯化，优选重复进行2次以上重结晶，例如在本专利技术优选的实施方式中，将反相色谱纯化工序中所得到马兜铃酸D粗品II用醇系溶剂溶解，于
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30℃～0℃结晶，过滤获得结晶，再进行2次以上重结晶。
[0023]在本专利技术优选的实施方式中，所述天仙藤药材总提取物溶液的制备方法如下，将天仙藤药材粉碎，加入5～20倍重量的醇系水溶液，室温浸泡或者热回流提取10～60小时，过滤，浓缩，得天仙藤药材总提取物溶液。
[0024]在本专利技术优选的实施方式中，反相色谱纯化工序可先进行中低压反相色谱纯化工序，再进行高压反相色谱纯化工序，其中例如，中低压反相色谱纯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：酸碱处理工序，将天仙藤药材总提取物粉末或浸膏，以3～7倍重量的pH值8～9的碱化的水溶液混悬，静置0.5～1.5小时后，再以0.8～4倍体积的有机溶剂萃取，回收水相，加入酸性水溶液，调节pH至3～4，用0.8～4倍体积的体积有机溶剂萃取，回收有机相，浓缩得到天仙藤总提取物II，聚酰胺纯化工序，将天仙藤总提取物II上样于100～200目聚酰胺柱层析，以乙酸乙酯：甲醇＝30:1～10:1洗脱液逐渐增加极性进行洗脱，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，天仙藤粗提物I，其中，甲醇中可选地含有8体积％～12体积％的甲酸以及8体积％～12体积％的水；反相色谱纯化工序：天仙藤粗提物I上样至反相色谱柱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.7:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液在50℃以下的温度减压浓缩，干燥得到马兜铃酸D的粗品II溶液，乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂中可选地含有0.1％～0.3％乙酸；溶剂处理工序，将反相色谱纯化工序中所得到马兜铃酸D的粗品II溶液在50℃以下的温度浓缩，得到析出物，淋洗，干燥之后获得马兜铃酸D的对照品。2.根据权利要求1所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，所述天仙藤药材总提取物溶液的制备方法如下，将天仙藤药材粉碎，加入5～20倍重量的醇系水溶液，室温浸泡或者热回流提取10～60小时，过滤，浓缩，得天仙藤药材总提取物溶液。3.根据权利要求1所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，反相色谱纯化工序先进行中低压反相色谱纯化工序，再进行高压反相色谱纯化工序，其中中低压反相色谱纯化工序：将天仙藤粗提物I上样至反相色谱柱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以0.5～1Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.6:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液在50℃以下的温度减压浓缩，去除其中的乙腈或甲醇，得到含有马兜铃酸D的粗品II
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1；高压反相色谱纯化工序：将马兜铃酸D的粗品II
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1上样至反相色谱柱，用可选地含有0....

【专利技术属性】
技术研发人员：冯光辉，赵坤，辛振强，舒亚平，李雪松，房强强，钱勇，
申请(专利权)人：上海诗丹德标准技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：