用于提取脂多糖的抽提液和方法技术

本发明专利技术属于脂多糖的制备领域，具体涉及一种用于提取脂多糖的抽提液和提取方法，所述提取方法包括以下步骤：（1）对培养得到的革兰氏阴性菌进行干燥；（2）将干燥后的革兰氏阴性菌加入抽提液中在20

【技术实现步骤摘要】
用于提取脂多糖的抽提液和方法


[0001]本专利技术涉及脂多糖(LPS)的制备领域。具体地，本专利技术涉及适于大规模生产的从革兰氏阴性菌提取LPS的抽提液和提取方法。

技术介绍

[0002]脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，是由脂质和多糖构成的物质（糖脂质）。脂多糖的结构复杂，在不同细菌类群、甚至菌株之间都有差异。以沙门氏菌为例，其脂多糖由核心多糖、O
‑
多糖侧链、和类脂A组成。脂多糖中的类脂A部分作为脂质双分子层外层的组成部分进入到脂质层中，糖链部分暴露在细胞外面，以这种形式存在于革兰氏阴性细菌的细胞表面。脂多糖是一种内毒素（Endotoxin），当其作用于人类或动物等其他生物细胞时，就会表现出多种的生物活性。脂多糖的生理作用是通过存在于宿主细胞的细胞膜表面的Toll样受体(TLR)4而体现的。
[0003]在培养革兰氏阴性菌后，通过对其进行提取获得脂多糖。其中由明尼苏达沙门氏菌R595菌株（Salmonella minnesota, strain R595）获得的脂多糖。在中等强度的无机酸溶液条件下酸水解可产生单磷酰脂质A（MPL）。经进一步的温和碱水解可获得3
‑
O
‑
脱酰基单磷酰脂质A (3D
‑
MPL)，3D
‑
MPL在疫苗佐剂中有着广泛的应用。
[0004]现有技术中提取脂多糖的一种方法是用氯仿和甲醇的混合物(CM)对革兰氏阴性菌进行提取，然后是一系列的甲醇沉淀步骤以去除磷脂。该方法的粗提取产物富含脂多糖和磷脂，其通常需要多个沉淀步骤以获得足够纯度的脂多糖，操作比较复杂且提取率较低，另一种方法中使用包含苯酚的溶剂进行提取，由于苯酚具有毒性，不适合大规模生产。因此，需要开发一种适于大规模生产、操作简便的脂多糖提取方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于提取脂多糖的抽提液和提取方法，可以在低温下进行提取，提取过程简单，适于大规模生产，同时还具有较高的提取率。
[0006]为了达到上述目的，一方面，本专利技术提供一种提取脂多糖的方法，包括以下步骤：（1）对培养得到的革兰氏阴性菌进行干燥；（2）将干燥后的革兰氏阴性菌加入抽提液中在20
‑
30℃进行提取，收集提取液；（3）浓缩所述提取液并加入预冷的有机溶剂，收集析出的沉淀得到脂多糖；其中所述抽提液由甲醇、氯仿和石油醚组成，甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3
‑
5)：(1
‑
2)：(5
‑
7)。
[0007]在一些实施方式中，所述石油醚的沸程为30
‑
60℃。
[0008]在一些实施方式中，步骤（2）中的革兰氏阴性菌在提取前被研磨成粉状。
[0009]在一些实施方式中，步骤（2）中提取温度为23
‑
27℃。
[0010]在一些实施方式中，步骤（2）中对革兰氏阴性菌的提取操作重复2
‑
3次，单次提取时间为2
‑
3小时。
[0011]在一些实施方式中，步骤（2）中抽提液体积与干燥细菌细胞重量的比例为5
‑
20ml/g。
[0012]在一些实施方式中，步骤（2）中通过离心或过滤来收集提取液。
[0013]在一些实施方式中，步骤（2）中的提取在底部具有过滤膜的反应釜中进行，提取后通过加压过滤收集提取液。
[0014]在一些实施方式中，所述过滤膜为不锈钢过滤膜，孔径1
‑
2μm，优选为1
‑
1.5μm，厚度为1~2mm，优选为1.5mm。
[0015]在一些实施方式中，步骤（2）中的提取在50~120rpm的搅拌下进行，优选为80
‑
100rpm。
[0016]在一些实施方式中，步骤（1）中在干燥前还包括利用溶剂清洗革兰氏阴性菌并去除所述溶剂的步骤，优选地，清洗次数为1
‑
3次。
[0017]在一些实施方式中，清洗革兰氏阴性菌采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种或多种。
[0018]在一些实施方式中，采用错流过滤的方式清洗革兰氏阴性菌。
[0019]在一些实施方式中，清洗革兰氏阴性菌在包含管式陶瓷膜的过滤单元中进行。
[0020]在一些实施方式中，所述管式陶瓷膜包含多个通道，孔径为0.1~0.5μm，优选为0.2μm。
[0021]在一些实施方式中，清洗完成后通过离心或过滤去除所述溶剂。
[0022]在一些实施方式中，所述预冷的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，预冷的温度为
‑
30℃至
‑
10℃，优选为
‑
25℃至
‑
15℃。
[0023]在一些实施方式中，浓缩所述提取液的方法为旋蒸法。
[0024]在一些实施方式中，所述革兰氏阴性菌选自明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota) R595、空肠弯曲菌(Compylobacter jejuni)、大肠杆菌(E. coli) K12菌株CS2429、大肠杆菌(E. coli) D31m4、大肠杆菌(E. coli)菌株F515和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株R45中的一种或多种。
[0025]另一方面，本专利技术还提供一种用于从革兰氏阴性菌提取脂多糖的抽提液，所述抽提液由甲醇、氯仿和石油醚组成，甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3
‑
5)：(1
‑
2)：(5
‑
7)。
[0026]在一些实施方式中，所述石油醚的沸程为30
‑
60℃。
[0027]又一方面，本专利技术还提供一种制备脂多糖衍生物的方法，包括以下步骤：（1）利用前述的方法提取脂多糖；（2）对所述脂多糖进行酸水解和/或碱水解得到脂多糖衍生物。
[0028]在一些实施方式中，对所述脂多糖进行酸水解得到磷酰脂质A（MPL）。
[0029]在一些实施方式中，对所述脂多糖先后进行酸水解和碱水解得到3
‑
O
‑
脱酰单磷酰脂质A(3D
‑
MPL)。
[0030]相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术所述方法中采用的抽提液包含甲醇和乙醇的至少一种醇、选自氯仿和二氯甲烷的至少一种卤代烃和石油醚，相对于现有技术中甲醇和氯仿组成的抽提液，本专利技术的提取可在常温下进行，操作条件简单，提取的脂多糖纯度较高，适于用作疫苗佐剂，而且可以用于制备单磷酰脂质A（MPL）或3
‑
O
‑
脱酰单磷酰脂质A(3D
‑
MPL)；本专利技术所述方法对革兰
: 1g等。
[0042]在本专利技术的实施方式中，步骤（2）中单次提取时间为2
‑
3小时，每批次的革兰氏阴性菌可重复提取2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取脂多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）对培养得到的革兰氏阴性菌进行干燥；（2）将干燥后的革兰氏阴性菌加入抽提液中在20
‑
30℃进行提取，收集提取液；（3）浓缩所述提取液并加入预冷的有机溶剂，收集析出的沉淀得到脂多糖；其中所述抽提液由甲醇、氯仿和石油醚组成，甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3
‑
5)：(1
‑
2)：(5
‑
7)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的革兰氏阴性菌在提取前被研磨成粉状。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述石油醚的沸程为30
‑
60℃。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中提取温度为23
‑
27℃。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中提取在50~120rpm的搅拌下进行。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中对革兰氏阴性菌的提取操作重复2
‑
3次，单次提取时间为2
‑
3小时。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中通过离心或过滤收集提取液。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的提取在底部具有过滤膜的反应釜中进行，提取后通过加压过滤收集提取液。9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述过滤膜为不锈钢过滤膜，孔径1
‑
2μm，厚度为1~2mm。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中抽提液体积与干燥细菌细胞重量的比例为5
‑
20ml/g。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中在干燥前还包括利用溶剂清洗革兰氏阴性菌并去除所述溶剂的步骤。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种或多种。13.根据权利要求11所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘娟，李璐，武建雨，刘勇，
申请(专利权)人：北京安百胜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：