一种乙型脑炎疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种乙型脑炎E重组蛋白，所述的乙型脑炎E重组蛋白包括乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2，所述乙型脑炎E重组蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙型脑炎E重组蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术同时公开了一种乙型脑炎亚单位疫苗，所述的疫苗含有所述的乙型脑炎E重组蛋白1或乙型脑炎E重组蛋白2。本发明专利技术制备的乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2均具有良好的免疫原性，且乙型脑炎E重组蛋白2较乙型脑炎E重组蛋白1具有更好的免疫原性。因此，本发明专利技术公开的这2个乙型脑炎E重组蛋白均可以作为乙型脑炎亚单位疫苗的重要的备选抗原，为乙型脑炎亚单位疫苗的研发提供重要的参考和借鉴。炎亚单位疫苗的研发提供重要的参考和借鉴。炎亚单位疫苗的研发提供重要的参考和借鉴。

【技术实现步骤摘要】
一种乙型脑炎疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种乙型脑炎疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]流行性乙型脑炎，又称日本乙型脑炎，简称乙脑，是由黄病毒科乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的人畜共患急性蚊媒病毒性传染病，发病高峰在蚊虫滋生的7
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9月。乙脑最早发现于日本。1871年才对该病有了初步的临床认识。乙脑对生猪养殖行业造成严重危害的重大疫病，主要影响母猪的繁殖性能，如妊娠母猪发生流产、死胎和木乃伊胎，公猪发生睾丸炎，可引起成年猪和育肥猪的持续高热，导致新生仔猪发生脑炎。
[0003]1935年，日本学者首次分离到JEV。1940年我国分离到JEV。JEV属于黄病毒科、黄病毒属，黄病毒属包含超过70种病毒，最主要的是导致人致病的黄热病毒(YFV)、JEV、西尼罗病毒(WNV)和登革热病毒(DV)。JEV分3个血清型：JaGAr、Nakayama和Mie(Intermediate Type)，它们的生物学特性(包括生长特性和毒力)不同。
[0004]JEV是单股正链RNA病毒，基因组长度为11kb，基因组结构如下图所示(图2)，JEV至少编码三种结构蛋白：核心蛋白(C)、膜蛋白(pr M/M)以及囊膜糖蛋白(E)。C蛋白C端疏水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上，有助装配成包裹基因组的核衣壳，使之免受核酸酶的破坏。M蛋白的前体蛋白Pr M对E蛋白的正确折叠、定位于膜上和最后的装配至关重要。E蛋白，主要结构蛋白是病毒粒子表面最重要的成分，它与病毒的吸附、穿入、致病和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。
[0005]现阶段针对JEV的防控主要是灭活疫苗和活疫苗，如地鼠肾细胞灭活疫苗、地鼠肾细胞减毒活疫苗。但是由于地鼠肾原代细胞基质缺乏WHO的认证，目前该疫苗主要在我国和韩国使用。因此，急需开发一种新型的乙型脑炎疫苗。

技术实现思路

[0006]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种乙型脑炎乙型脑炎E重组蛋白及其制备方法和应用。
[0007]因此，本专利技术一方面提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白为乙型脑炎E重组蛋白，所述的乙型脑炎E重组蛋白包括乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2，所述乙型脑炎E重组蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙型脑炎E重组蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]优选地，本专利技术所述的乙型脑炎E重组蛋白2由B细胞抗原表位、结合MHC I类分子的抗原表位、乙型脑炎E重组蛋白1的aa3～aa400、诱导产生IFN
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γ的抗原表位、6His标签以及连接子组成。
[0009]优选地，本专利技术所述的B细胞抗原表位的氨基酸序列为SEKIFEIRFETNDK KS。
[0010]优选地，本专利技术所述的结合MHC I类分子的抗原表位的氨基酸序列为YTY NFDFDY。
[0011]优选地，本专利技术所述的诱导产生IFN
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γ的抗原表位的氨基酸序列分别为LK PLKFNTE。
[0012]优选地，本专利技术所述的连接子的氨基酸序列分别为GGGGSGGGGS。
[0013]再一方面，本专利技术还提供了一种乙型脑炎亚单位疫苗，所述的疫苗含有所述的乙型脑炎E重组蛋白1。
[0014]再一方面，本专利技术还提供了一种乙型脑炎亚单位疫苗，所述的疫苗含有所述的乙型脑炎E重组蛋白2。
[0015]本专利技术制备的乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2均具有良好的免疫原性，且乙型脑炎E重组蛋白2较乙型脑炎E重组蛋白1具有更好的免疫原性。因此，本专利技术公开的这2个乙型脑炎E重组蛋白均可以作为乙型脑炎亚单位疫苗的重要的备选抗原，为乙型脑炎亚单位疫苗的研发提供重要的参考和借鉴。
附图说明
[0016]图1乙型脑炎E蛋白跨膜区分析结果。Inside表示胞内区，inside数值越大，表示该氨基酸位于胞内区的可能性越大；Outside表示胞外区，outside数值越大，表示该氨基酸位于胞外区的可能性越大；Transmembrane表示跨膜区，Transme mbrane数值越大，表示该氨基酸在跨膜区的可能性越大。
[0017]图2乙型脑炎E重组蛋白2的SDS
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PAGE图，其中1是纯化后的乙型脑炎E重组蛋白2。
具体实施方式
[0018]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0019]除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0020]实施例1：乙型脑炎E重组蛋白的制备
[0021]1.1乙型脑炎E重组蛋白1的制备
[0022]从NCBI中选择一株近年分离鉴定毒株的E蛋白(GenBank:UQR78754.1)，对其跨膜区进行分析，结果如图1所示，N端450氨基酸为胞外区，因此，去除N端451～500氨基酸，对剩余的450氨基酸的蛋白(SEQ ID NO.1所示，为区别后续重组蛋白，将其命名为乙型脑炎E重组蛋白1)进行重组蛋白的制备(制备时在C端增加6His标签，以方便纯化)。
[0023]使用常规的昆虫杆状病毒表达体系对上述的乙型脑炎E重组蛋白1进行表达。简述如下：
[0024]选用密码子优化的乙型脑炎E重组蛋白1核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)，以此为模板，插入BamHI和XhoI酶切位点及6His标签，然后将目的基因和载体pFastBac1进行双酶切，连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取阳性菌扩增培养并提取重组质粒(pFastBac1
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E1)，将鉴定阳性的重组质粒加入E.coli DH10Bac感受态细胞中进行转座，选
取白斑菌鉴定培养获得重组Bac mid。在转染试剂Cellfectin ReagentⅡ的作用下，转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒种毒。
[0025]将Bac
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PEDV
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E1病毒液接种细胞悬液，按MOI＝1的比例接种于生长状态良好SF9细胞(汇合度＞80％)，于28℃、120rpm振荡培养96小时，若细胞出现明显病变(细胞变大变圆)，收集细胞培养液，6000r/min 4℃离心10分钟，取上清备用；用镍柱纯化蛋白，用400mM咪唑溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；透析换液后过0.22μm滤膜除菌，置于
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80℃保存备用。
[0026]经过上述步骤，虽然能成功的制备、纯化得到乙型脑炎E重组蛋白1，但是产量较低(＜50mg/L)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，所述重组蛋白为乙型脑炎E重组蛋白，其特征在于，所述的乙型脑炎E重组蛋白包括乙型脑炎E重组蛋白1和乙型脑炎E重组蛋白2，所述乙型脑炎E重组蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙型脑炎E重组蛋白2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述的乙型脑炎E重组蛋白2由B细胞抗原表位、结合MHCI类分子的抗原表位、乙型脑炎E重组蛋白1的aa3～aa400、诱导产生IFN
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γ的抗原表位、6His标签以及连接子组成。3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述的B细胞抗原表位的氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：马贵均，耿开通，
申请(专利权)人：广州杰博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：