一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用，该融合葡萄糖氧化酶包括原料组分野生型葡萄糖氧化酶和碱性氨基酸侧链。该制备方法包括制备由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接精氨酸构成的融合葡萄糖氧化酶和由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接组氨酸构成的融合葡萄糖氧化酶。该应用包括所述融合葡萄糖氧化酶在电化学传感器方面的应用。本发明专利技术制备方法简单易行，便于大量制备所述融合葡萄糖氧化酶，具有很好的应用前景，所形成的融合葡萄糖氧化酶具有较高的电子传递效率，所制作的电化学传感器具有较高的灵敏度和较快的响应速度，更适用于制作电化学传感器。器。器。

【技术实现步骤摘要】
一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]葡萄糖氧化酶是一种黄素蛋白(flavoprotein)，以分子氧为电子受体将β
‑
D
‑
葡萄糖催化反应成葡萄糖酸内酯与过氧化氢。在该催化反应过程中包括还原反应与氧化反应。在还原反应中，葡萄糖氧化酶将β
‑
D
‑
葡萄糖还原成葡萄糖酸内酯，其中葡萄糖酸内酯能够在非酶促反应下转化成葡萄糖酸，随后葡萄糖氧化酶中的辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)被还原成还原态的葡萄糖氧化酶
‑
FADH2。在氧化反应中，还原态的葡萄糖氧化酶
‑
FADH2通过与分子氧反应被重新氧化成葡萄糖氧化酶
‑
FAD，并生成过氧化氢。且葡萄糖氧化酶对β
‑
D
‑
葡萄糖具有严格的底物专一性，而对其他糖化合物仅具有较弱的催化能力。β
‑
D
‑
葡萄糖的C
‑
1位在分子氧的存在下被氧化成1,5
‑
葡萄糖内酯，随后自发水解为D
‑
葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶的主要作用是制成生物传感器，属于糖尿病临床检测中的主要工具之一。
[0003]血糖传感器是以葡萄糖氧化酶为主要工作酶，通过电极监测葡萄糖氧化酶蛋白上电子的变化情况来计算血样中的葡萄糖水平，也有研究报道对血糖传感器进行了改良，可以通过荧光检测葡萄糖氧化酶结构内FAD的变化来进行测算葡萄糖浓度。除了用于制作便携血糖检测器外，葡萄糖氧化酶还能作为生物传感器被应用于其他方面，如作为光纤生物传感器用于分析饮料中葡萄糖的浓度，还可以应用于在血清检测仪中。
[0004]葡萄糖氧化酶作为酶电化学传感器的一种主要酶，其与电极间存在电子传递，具体的，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，被氧化成葡萄糖酸(Glucola ctone)，铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾，即三价铁(Fe
3+
)得到一个电子变成二价铁(Fe
2+
)；葡萄糖氧化酶变成还原态，然后又催化Fe
2+
氧化成Fe
3+
，即亚铁氰化钾被氧化成铁氰化钾，同时释放出一个电子，该反应在恒电位的作用下即可形成电流，通过检测电流变化可以算出酶制作的电化学传感器灵敏度。大多数天然酶的氧化还原中心被深埋在分子内部，氧化还原中心的外围有一绝缘的包围圈。这层包围圈可以避免电子的随意流动节约能量，但是用此类天然酶来制作电化学传感器时，使得酶与电极间很难直接进行电子传递。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用，具体技术方案如下：
[0006]在第一方面，本专利技术提供了一种融合葡萄糖氧化酶，包括以下原料组分：野生型葡萄糖氧化酶和碱性氨基酸侧链；所述野生型葡萄糖氧化酶为黑曲霉A.niger BBE11721的葡萄糖氧化酶，其基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述碱性氨基酸侧链包括精氨酸和组氨酸中的任意一种。
[0007]可选的，所述融合葡萄糖氧化酶由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接组氨酸构成。
[0008]可选的，所述融合葡萄糖氧化酶由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接精氨酸构成。
[0009]在第二方面，本专利技术提供了一种制备所述融合葡萄糖氧化酶的制备方法，包括以下步骤：
[0010]步骤S1：将所述野生型葡萄糖氧化酶碱基序列进行基因合成，并在野生型葡萄糖氧化酶碱基序列的5
’
端加入酶切位点SnaBI序列，在3
’
端键入NotI序列；
[0011]步骤S2：首先，将质粒载体pPIC9K及由步骤S1合成后的野生型葡萄糖氧化酶碱基序列均采用SnaBI和NotI双酶切，回收切开后的野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段和目标质粒片段，并分别测定野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段的质量浓度和目标质粒片段的质量浓度；其次，将野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段与目标质粒片段按照质量比3：1配置20ul；然后，加入连接酶，并于16℃水浴连接过夜，获得连接产物；
[0012]步骤S3：将所述连接产物转化至大肠杆菌细胞中，采用氨苄青霉素筛选阳性克隆并测序，测序同SEQ ID NO.1的菌种扩大培养并提取目标产物保存；
[0013]步骤S4：将寡聚核苷酸序列进行基因合成，所述寡聚核苷酸序列是由连接肽与组氨酸组合的序列；使用引物对合成后的寡聚核苷酸序列进行PCR扩增，使其具有无缝克隆所需的同源臂；将步骤S3获得的所述目标产物采用SacI酶线性化后；采用无缝克隆试剂盒对SacI酶线性化后的目标产物和扩增后的寡聚核苷酸序列分别进行无缝克隆；对无缝克隆完成的产物进行测序；
[0014]步骤S5：将测序后的产物转化至GS115菌液中，将所述菌液涂布于MD平板，并于30℃条件下恒温培养3
‑
5天，观察菌落生长情况，挑选生长良好的菌落，做菌落PCR鉴定，将阳性菌保种，获得融合葡萄糖氧化酶。
[0015]在第二方面，本专利技术又提供了一种制备所述融合葡萄糖氧化酶的制备方法，包括以下步骤：
[0016]步骤S1：将所述野生型葡萄糖氧化酶碱基序列进行基因合成，并在野生型葡萄糖氧化酶碱基序列的5
’
端加入酶切位点SnaBI序列，在3
’
端键入NotI序列；
[0017]步骤S2：首先，将质粒载体pPIC9K及由步骤S1合成后的野生型葡萄糖氧化酶碱基序列均采用SnaBI和NotI双酶切，回收切开后的野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段和目标质粒片段，并分别测定野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段的质量浓度和目标质粒片段的质量浓度；其次，将野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段与目标质粒片段按照质量比3：1配置20ul；然后，加入连接酶，并于16℃水浴连接过夜，获得连接产物；
[0018]步骤S3：将所述连接产物转化至大肠杆菌细胞中，采用氨苄青霉素筛选阳性克隆并测序，测序同SEQ ID NO.1的菌种扩大培养并提取目标产物保存；
[0019]步骤S4：将寡聚核苷酸序列进行基因合成，所述寡聚核苷酸序列是由连接肽与精氨酸组合的序列；使用引物对合成后的寡聚核苷酸序列进行PCR扩增，使其具有无缝克隆所需的同源臂；将步骤S3获得的所述目标产物采用SacI酶线性化后；采用无缝克隆试剂盒对SacI酶线性化后的目标产物和扩增后的寡聚核苷酸序列分别进行无缝克隆；对无缝克隆完成的产物进行测序；
[0020]步骤S5：将测序后的产物转化至GS115菌液中，将所述菌液涂布于MD平板，并于30℃条件下恒温培养3
‑
5天，观察菌落生长情况，挑选生长良好的菌落，做菌落PCR鉴定，将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合葡萄糖氧化酶，其特征在于，包括以下原料组分：野生型葡萄糖氧化酶和碱性氨基酸侧链；所述野生型葡萄糖氧化酶为黑曲霉A.nigerBBE11721的葡萄糖氧化酶，其基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述碱性氨基酸侧链包括精氨酸和组氨酸中的任意一种。2.根据权利要求1所述的融合葡萄糖氧化酶，其特征在于，由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接组氨酸构成。3.根据权利要求1所述的融合葡萄糖氧化酶，其特征在于，由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接精氨酸构成。4.一种制备如根据权利要求2所述的融合葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1：将所述野生型葡萄糖氧化酶碱基序列进行基因合成，并在野生型葡萄糖氧化酶碱基序列的5
’
端加入酶切位点SnaBI序列，在3
’
端键入NotI序列；步骤S2：首先，将质粒载体pPIC9K及由步骤S1合成后的野生型葡萄糖氧化酶碱基序列均采用SnaBI和NotI双酶切，回收切开后的野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段和目标质粒片段，并分别测定野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段的质量浓度和目标质粒片段的质量浓度；其次，将野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段与目标质粒片段按照质量比3：1配置20ul；然后，加入连接酶，并于16℃水浴连接过夜，获得连接产物；步骤S3：将所述连接产物转化至大肠杆菌细胞中，采用氨苄青霉素筛选阳性克隆并测序，测序同SEQ ID NO.1的菌种扩大培养并提取目标产物保存；步骤S4：将寡聚核苷酸序列进行基因合成，所述寡聚核苷酸序列是由连接肽与组氨酸组合的序列；使用引物对合成后的寡聚核苷酸序列进行PCR扩增，使其具有无缝克隆所需的同源臂；将步骤S3获得的所述目标产物采用SacI酶线性化后；采用无缝克隆试剂盒对SacI酶线性化后的目标产物和扩增后的寡聚核苷酸序列分别进行无缝克隆；对无缝克隆完成的产物进行测序；步骤S5：将测序后的产物转化至GS115菌液中，将所述菌液涂布于MD平板，并于30℃条件下恒温培养3
‑
5天，观察菌落生长情况，挑选生长良好的菌落，做菌落PCR鉴定，将阳性菌保种，获得融合葡萄糖氧化酶。5.一种制备如根据权利要求3所述的融合葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1：将所述野生型葡萄糖氧化酶碱基序列进行基因合成，并在野生型葡萄糖氧化酶碱基序列的5
’
端加入酶切位点SnaBI序列，在3
’
端键入NotI序列；步骤S2：首先，将质粒载体pPIC9K及由步骤S1合成后的野生型葡萄糖氧化酶碱基序列均采用SnaBI和NotI双酶切，回收切开后的野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段和目标质粒片段，并分别测定野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段的质量浓度和目标质粒片段的质量浓度；其次，将野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段与目标质粒片段按照质量比3：1配置20ul；然后，加入连接酶，并于16℃水浴连接过夜，获得连接产物；步骤S3：将所述连接产物转化至大肠杆菌细胞中，采用氨苄青霉素筛选阳性克隆并测序，测序同SEQ ID NO.1的菌种扩大培养并提取目标产物保存；步骤S4：将寡聚核苷酸序列进行基因合成，所述寡聚核苷酸序列是由连接肽与精氨酸
组合的序列；使用引物对合成后的寡聚核苷酸序列进行PCR扩增，使其具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄微，
申请(专利权)人：可孚医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：