一种串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白的制备和应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，提供了一种串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白的制备和应用，采用预测工具根据分析出的亲水性、疏水性、可塑性、表面活性等指标，成功预测了五种毒力基因的抗原表位，并通过基因工程技术对预测的这五种抗原基因融合并进行串联表达，制备了融合蛋白抗原；同时，将串联羊源大肠杆菌五种毒力基因的融合蛋白制作成亚单位疫苗，取得了良好的免疫保护效果。本发明专利技术成功构建了重组羊源大肠杆菌毒力基因原核表达质粒pET28a

【技术实现步骤摘要】
一种串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白的制备和应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，提供了一种串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白的制备和应用。

技术介绍

[0002]大肠杆菌病是各种养殖动物最常发的细菌病之一，不同动物的致病性大肠杆菌有其宿主专一性。羊大肠杆菌病主要是由羊源大肠杆菌引起的一种以腹泻为主要特征的疾病，近几年严重危害羔羊的健康和成活率。动物源大肠杆菌的致病力与多种毒力因子有关，例如，粘附素在大肠杆菌的发病机制中是必不可少的，因为细菌与宿主细胞相结合是建立感染的一个重要步骤；铁离子摄取转运系统对于细胞在可用性铁离子含量较低的环境中生存非常重要。因此，许多肠道外致病性大肠杆菌菌株获得了包括铁载体在内的多种铁转运系统，以调控宿主细胞对铁的吸收过程，从而产生致病性。保护素和血清抵抗蛋白是细菌的表面结构，如脂多糖、包膜蛋白和外膜蛋白，主要是通过促进补体系统的作用来保护细菌自身。
[0003]肠细胞脱落位点(Locus of Enterocyte Effacement,LEE)毒力岛在STEC与宿主粘膜的刷状缘结合时发挥毒性作用，通过破坏肠上皮细胞功能来促进细胞骨架重组和特征性组织病变的形成，称为“附着和消失”(Attaching and Effacing lesion,A/E)病变。这一过程主要与分泌型蛋白质(esp)及其分子伴侣，外膜蛋白紧密素(eae A)和紧密素易位受体(tir)以及基因相近的调节蛋白基因(ler)等有关，其中eae基因编码的紧密黏附素通过易位受体(tir)介导与宿主细胞的紧密附着。这些细菌的外膜蛋白也是良好的抗原候选。
[0004]铁摄取系统是致病性大肠杆菌产生致病力的关键。虽然革兰氏阴性病原体中存在许多铁的获取机制，但到目前为止，好氧肌动蛋白系统的特征性最为明显。该系统包括由致病性大肠杆菌所表达的合成羟基化铁嗜铁细胞好氧肌动蛋白(iuc)基因和铁嗜铁肌动蛋白摄取(iut)基因。Johnson等研究发现这些基因被定位到ColV质粒上一个93kb的假定毒性基因簇的保守区域，ColV质粒上的其他铁获取和转运系统还包括salmochelin含铁细胞系统、sitABC铁转运系统和新发现的红细胞铁转化系统。除了质粒载体因子外，耶尔森菌强毒力岛(high pathogenecity island,HPI)也是细菌主要的铁摄取系统毒力因子。因此，铁系统相关的抗原作为重要的毒力因子是良好的疫苗候选抗原。
[0005]有研究表明，Ⅰ型菌毛由fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH 9个基因编码。其中fimC是胞质的侣伴蛋白,它是由2个免疫球蛋白样折叠的球状区域组成,2个球状区域之间由15个氨基酸残基组成的肽链相连,且两个区域的相对分布主要取决于一些疏水性氨基酸的区域内部连接，fimC主要介导大肠杆菌Ⅰ型菌毛的装配，是大肠杆菌中重要的毒力因子。
[0006]操纵子hlyA可以调控大肠杆菌α
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溶血素的合成、分泌和活化。该操纵子位于染色体上的毒力岛或者某些特定基因型的可转移质粒上，因此I型分泌系统的遗传因素可以在革兰氏阴性菌中进行水平转移。hlyA同时存在多种转录调控机制。hlyA编码产生的溶血素
前体，可以经氨基酸转移酶酰化为具有活性的毒素。hlyB、hlyC同时编码膜转运蛋白，与多系统通用外膜蛋白ToIC共同参与hlyA的分泌。
[0007]P菌毛是一种大肠杆菌入侵动物机体的重要黏附素。编码P菌毛的pap粘附基因群位于大肠杆菌的染色体上。P菌毛通过其尖端粘附素能与泌尿道上皮细胞表面P血型抗原物质Gal
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Gal特异性结合,是形成上行性感染的关键步骤。因此,papC基因是pap基因群中的重要组成，在大肠杆菌鉴定及其致病机理的研究中具有十分重要的意义。
[0008]上述这些致病因子往往可以被动物机体免疫系统识别，并产生抗体，但是单一抗原的抗体对细菌的保护效果较差，多抗原表位抗体理论上具有更好的保护效果。串联表达技术主要避开需要表达基因的高变异区并剔除多余的片段，主要在于选取目的基因的高效中和抗原表位区进行串联得到新的重组基因，再利用原核系统将重组蛋白进行表达。陈如敬等选取(PRRSV)GP5蛋白已鉴定的抗原表位(aa3l
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37和aal92
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l98)进行串联后克隆到原核表达载体PGEX
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6P
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1上，转化E.co1i BL21后进行条件优化诱导表达，结果显示该重组蛋白具有良好的免疫学活性：李明等将猪链球菌2型MRP与GPF基因串联表达，实验结果显示串联的融合蛋白能产生更高的针对MRP和EPF的效价。因此，为了最大可能性增加抗原表位数量，提高抗原免疫效果，并保证抗原较容易制备，能否针对羊源大肠杆菌的多个毒力基因，筛选有效的抗原表位，并利用上述串联表达技术技术更精准高效地表达羊大肠杆菌毒力基因的抗原表位，从而开发相应的疫苗来更好的预防和治疗羊大肠杆菌病成为本领域亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0009]本专利技术针对上述技术存在的不足，最终选择了外膜蛋白紧密素eaeA、好氧肌动蛋白iucD、Ⅰ型菌毛fimC、操纵子hlyA、P菌毛papC五种毒力基因，并预测筛选主要的抗原表位，并通过基因工程技术串联表达，提供了一种串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白的制备和应用，采用预测工具根据分析出的亲水性、疏水性、可塑性、表面活性等指标，成功预测了五种毒力基因的抗原表位，并对预测的抗原结构进行串联表达，提高了试验的成功率；同时，串联羊源大肠杆菌毒力基因的融合蛋白在制备抗病毒药物以及预防保护机制中也发挥了重要作用，本专利技术成功构建了重组羊源大肠杆菌毒力基因原核表达质粒pET28a
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S12345，实现了羊源大肠杆菌在大肠杆菌原核系统上的串联表达。
[0010]本专利技术申请人最终决定针对羊源大肠杆菌中铁摄取系统以及LEE毒力岛的五种毒力基因为主要抗原表位进行串联表达，这一专利技术不仅可以用于制备羊的抗细菌药物，而且可以作为疫苗用抗原用于大肠杆菌病的预防保护工作；具体选择了羊源大肠杆菌eaeA、iucD、fimC、hlyA、papC五种毒力基因来设计并构建融合基因，并通过原核表达系统表达该融合蛋白。原核表达系统表达的融合蛋白易于生产、成本低、活性高，能够维持细菌性抗原蛋白的天然结构，适合细菌性抗原成分的表达和应用。
[0011]本申请的具体技术方案如下：
[0012]一种串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013]该融合蛋白的具体制备方法如下：
[0014](1)抗原表位的预测与选择：以羊源大肠杆菌的五段毒力基因序列为模板，运用
DNAStar Protien软件的Protean子模块对五种毒力基因的二级结构进行预测，采用Garnier
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Robson和Chou
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白，其特征在于：其核苷酸序列中包含五个抗原表位S1、S2、S3、S4、S5的基因片段，以及如SEQ ID NO.1所示的柔性氨基酸碱基序列。3.根据权利要求1串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白，其特征在于：抗原表位S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；抗原表位S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；抗原表位S3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；抗原表位S4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；抗原表位S5的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。4.权利要求1所述串联羊源大肠杆菌毒力基因融合蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)抗原表位的预测与选择：以羊源大肠杆菌的五段毒力基因序列为模板，对蛋白进行抗原性分析，选取五段毒力基因中抗原活性最高的五个区域，将其命名为S1、S2、S3、S4、S5；(2)目的片段的合成：将五个抗原表位S1、S2、S3、S4、S5的基因片段之间以如SEQ ID NO.1所示的柔性氨基酸碱基序列连接，在目的片段两端分别带有XhoI和BamHI，将串联的五段基因命名为S12345，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；上述抗原表位S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；抗原表位S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；抗原表位S3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；抗原表位S4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏凯，蒋昀轩，孙振红，闫国宁，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：