一株高产DHA的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用技术

本发明专利技术提供高产DHA的重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌是在裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20888中通过敲除lipR蛋白同时过表达甘油

【技术实现步骤摘要】
一株高产DHA的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种高产DHA的重组工程菌株，还涉及所述重组菌株的构建方法，及其在生产DHA中的应用。
技术背景
[0002]二十二碳六烯酸(decosahexaeonic acid，DHA)是一种重要的ω
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3长链多不饱和脂肪酸，传统的DHA生产原料主要来源于鱼油，但难以实现高价值产品在食品和医药行业中的广泛应用。为满足DHA不断增长的市场需求，近年来，科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA的研究。裂殖壶菌因其生长速度快、油含量高、DHA比例高，是当前DHA产业化的主要生产菌。
[0003]裂殖壶菌是一种含油量极高的海洋微藻，菌体含油量最高可达到50％以上，且其脂肪酸组成简单，DHA可占总脂肪酸含量的35％以上。裂殖壶菌发酵生产DHA的工艺已相对成熟，如何进一步提高DHA生产效率、降低生产成本是近年来研究的重点。裂殖壶菌发酵生产DHA的工艺过程可分为菌种筛选、发酵控制、高密度发酵、细胞获取、油脂提取和纯化。为了提高裂殖壶菌的发酵水平，目前的研究主要集中在菌种性能的改良、结合DHA合成途径借助分子操作进行代谢调控、发酵过程的优化和油脂的提取纯化等方面。
[0004]本专利技术通过在裂殖壶菌中敲除lipR蛋白的同时过表达甘油
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磷酸酰基转移酶(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)达到提高裂殖壶菌中三酰甘油含量的目的，然后再过表达柠檬酸裂解酶(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)以提高乙酰辅酶A和NADPH的含量，从而提高DHA含量，得到一株能高产DHA的裂殖壶菌重组菌株。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提高裂殖壶菌中DHA含量，通过对三酰甘油合成途径中关键基因的过表达提高裂殖壶菌中油脂含量，进一步过表达乙酰辅酶A和NADPH合成途径中关键基因从而提高DHA合成所需要的前体物质，提供一种高产DHA的重组工程菌株，以及该重组菌株的构建方法和应用。
[0006]本专利技术的思路是通过在裂殖壶菌中调控关键基因的表达来调节总油脂和前体物质乙酰辅酶A和NADPH的合成，敲除lipR蛋白的同时过表达甘油
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磷酸酰基转移酶(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)达到提高裂殖壶菌中三酰甘油含量的目的，然后再过表达柠檬酸裂解酶(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)以提高乙酰辅酶A和NADPH的含量，从而提高裂殖壶菌中DHA的含量，得到一株能高产DHA的裂殖壶菌重组菌株，其合成路线如图1所示。
[0007]基于此，本专利技术提供高产DHA的重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌是在裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20888中通过敲除lipR蛋白同时过表达甘油
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磷酸酰基转移酶基因(GPAT)、二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)、柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)构建而成的。
[0008]在本专利技术中，所述甘油
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磷酸酰基转移酶基因(GPAT)的序列如SEQ ID No.1所示，二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)的序列如SEQ ID No.2所示，柠檬酸裂解酶基因(ACL2)的序列如SEQ ID No.3所示，6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH2)的序列如SEQ ID No.4所示。
[0009]本专利技术还提供上述重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)构建GPAT基因和DGAT基因过表达质粒
[0011]根据测序获得的lipR蛋白基因序列设计引物lipRup
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F和lipRup
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R以及lipRdown
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F和lipRdown
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R扩增得到裂殖壶菌(Schizochytriumsp.ATCC20888)的上下游同源臂并连接到pJN44载体上，分别得到重组质粒pJN44
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lipRup和pJN44
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lipRdown，然后通过酶切将胶回收的lipRup片段和lipRdown片段连接到PBS
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Zeo载体上，得到重组质粒PBS
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Zeo
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lipR，经验证正确后用于后续实验。
[0012]获取并合成来源于解脂亚罗酵母的GPAT基因和DGAT基因序列，以及ccg1启动子和终止子片段，将ccg1启动子、GPAT基因片段、DGAT基因片段和ccg1终止子依次连接到载体pJN44的多酶切位点SpeI/SmaI、SmaI/MfeI、MfeI/BstEⅡ和BstEⅡ/BamHI上，构建得到含有GPAT和DGAT表达盒的质粒pJN44
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GPAT/DGAT，然后将重组质粒pJN44
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GPAT/DGAT中含目的基因的表达盒用SpeI/BamHI酶切并连接至载体PBS
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Zeo
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lipR上，得到重组质粒PBS
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Zeo
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GPAT/DGAT
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lipR，经验证正确后用于后续实验。
[0013]其中，lipR基因序列如SEQ ID No.5所示；
[0014](2)构建含有甘油
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磷酸酰基转移酶基因(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)的重组工程菌株
[0015]将上述验证正确的重组质粒PBS
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Zeo
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GPAT/DGAT
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lipR线性化后取10μg转化到100μL裂殖壶菌感受态中，置于0.1cm间隙的电转杯中进行电穿孔(1.5KV，200Q，50uF，两次)。然后加入1mL种子培养基，28℃孵育4h，取300μL菌液均匀涂于含100μg/mL zeocin的博莱霉素种子筛选培养基，28℃避光培养48h待长出单菌落后做菌落PCR验证及测序验证，正确的重组菌命名为裂殖壶菌AT
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GD。
[0016]裂殖壶菌感受态制备：裂殖壶菌细胞在种子培养基中培养24h，离心(5900g，4℃，5min)收获菌体细胞，用预冷的无菌水和1M山梨醇洗涤3次，随后在1M山梨醇中重悬。
[0017](3)构建含有柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)的重组工程菌株
[0018]从NCBI上获取来源于裂殖壶菌、解脂亚罗酵母和希瓦氏菌的柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)序列信息，添加酶切位点送生工合成，将合成片段ACL1，ACL2，ACL3，G6PDH1，G6PDH2，G6PDH3与质粒pPICZαA分别经酶切连接获得重组质粒pPICZαA
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ACL1，pPICZαA
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ACL2，pPICZαA
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ACL3，和pPICZ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高产DHA的重组裂殖壶菌，其特征在于所述重组裂殖壶菌是敲除lipR蛋白并过表达甘油
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磷酸酰基转移酶基因GPAT、二酰甘油酰基转移酶基因DGAT、柠檬酸裂解酶基因ACL和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH的裂殖壶菌。2.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述重组裂殖壶菌的出发菌株是裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20888。3.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述甘油
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磷酸酰基转移酶基因GPAT和二酰甘油酰基转移酶基因DGAT来源于解脂亚罗酵母Yarrowia lipolytica，所述柠檬酸裂解酶基因ACL和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH分别来源于裂殖壶菌、解脂亚罗酵母或希瓦氏菌。4.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述甘油
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磷酸酰基转移酶基因GPAT、二酰甘油酰基转移酶基因DGAT、柠檬酸裂解酶基因ACL和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH来源于解脂亚罗酵母；所述甘油
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磷酸酰基转移酶基因GPAT的核酸序列如SEQ ID No.1所示，二酰甘油酰基转移酶基因DGAT的核酸序列如SEQ ID No.2所示，柠檬酸裂解酶基因ACL2的核酸序列如SEQ ID No.3所示，6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH2的核酸序列如SEQ ID No.4所示。5.高产DHA的重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建GPAT基因和DGAT基因过表达质粒根据lipR蛋白基因序列设计引物lipRup
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F和lipRup
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R以及lipRdown
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F和lipRdown
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R扩增得到裂殖壶菌的上下游同源臂并连接到pJN44载体上，分别得到重组质粒pJN44
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lipRup和pJN44
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lipRdown，然后通过酶切将胶回收的lipRup片段和lipRdown片段连接到PBS
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Zeo载体上，得到重组质粒PBS
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Zeo
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lipR；获取并合成来源于解脂亚罗酵母的GPAT基因和DGAT基因序列，以及ccg1启动子和终止子片段，将ccg1启动子、GPAT基因片段、DGAT基因片段和次连接到载体pJN44的多酶切位点上，构建得到含有GPAT和DGAT表达盒的重组质粒pJN44
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GPAT/DGAT，然后将重组质粒pJN44
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GPAT/DGAT中含目的基因的表达盒用SpeI/BamHI酶切并连接至载体PBS
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Zeo
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lipR上，得到重组质粒PBS
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Zeo
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GPAT/DGAT
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lipR；(2)构建含有甘油
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磷酸酰基转移酶基因GPAT和二酰甘油酰基转移酶基因DGAT的重组工程菌株经验证正确的重组质粒PBS
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Zeo
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GPAT/DGAT
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lipR线性化后转化到裂殖壶菌感受态中，然后在28℃避光培养48h，待长出单菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：苟元元，杨璐，郭建琦，牛永洁，孟永宏，
申请(专利权)人：陕西海斯夫生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：