【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程。更具体地，本专利技术涉及一种提高香兰素产量的重组拟无枝酸菌，还涉及所述拟无枝酸菌在生产香兰素中的应用。
技术介绍
1、香兰素(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，又称香草醛，是世界上使用最广泛的调味料之一，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用。目前全球对香兰素的需求约为2万吨。目前市场上香兰素的供应有三种，(1)从香荚兰豆中提取的天然香兰素；(2)用化学合成法生产的香兰素；(3)用微生物转化法生产的香兰素。由于植物提取法和化学合成法存在种种不足，致使人们越来越重视微生物转化法生产香兰素，其中，丁香酚、异丁香酚和阿魏酸是该法生产香兰素的主要底物。但是丁香酚、异丁香酚毒性大，阿魏酸价格高，因此，寻求安全廉价的原料来生产香兰素是一个重要的研究方向。
2、由于葡萄糖价格低廉，原料充足，且安全无毒，是生物合成香兰素的理想原料。hansen等研究表明，通过代谢工程改造后的酵母菌株，包括裂殖酵母和酿酒酵母分别以葡萄糖为底物，可获得65mg/l和45mg/l的香兰素，然而酵母具有较强的香兰素代谢能力，使得产量降低和副产物的生成。中国专利技术专利申请cn 106032538a构建了一株代谢工程大肠杆菌，通过转入5个外源基因，经过苯丙烷途径生成香兰素，但其产量低，且香兰素对大肠杆菌毒性大，不利于其积累。专利技术专利申请cn 114703113a通过在拟无枝酸菌中表达酪氨酸解氨酶基因tal、对香豆酸-3-羟化酶基因sam5和咖啡酸甲基转移酶基因com，并缺失预苯酸脱水酶基因，实现了以葡萄糖为原料生物合成香兰素，摇瓶
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术方案，通过基因改造提供一种高产香兰素产量的重组拟无枝酸菌。
2、基于该目的，本专利技术提供拟无枝酸菌调控蛋白tyrr1基因缺失在提高拟无枝酸菌以葡萄糖为底物发酵产香兰素的香兰素产量重点的应用，所述tyrr1的基因序列如seq idno:1所示，其编码的蛋白质登录号为wp_020416143.1。
3、本专利技术还提供过表达tyra-arof基因在提高拟无枝酸菌以葡萄糖为底物发酵产香兰素的香兰素产量重点的应用，所述tyra是分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶双功能酶基因，其核酸序列如seq id no:2所示，其编码的蛋白质登录号为wp_020419478.1，所述arof基因是3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因，arof的基因序列如seq id no:3所示，其编码的蛋白质登录号为wp_020418838.1。
4、进一步地，本专利技术提供一种高产香兰素产量的重组拟无枝酸菌，所述重组拟无枝酸菌敲除了拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)的调控蛋白基因tyrr1和丙酮酸激酶基因pyk，过表达拟无枝酸菌内源的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶双功能酶基因tyra、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof和磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa。
5、在本专利技术中，基因tyrr1的核苷酸序列如seq id no:1所示，基因tyra的核苷酸序列如seq id no:2所示，基因arof的核苷酸序列如seq id no:3所示，基因pyk的核苷酸序列如seq id no:4所示，基因ppsa的核苷酸序列如seq id no:5所示。
6、另一方面，本专利技术还提供上述重组拟无枝酸菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
7、(1)构建tyrr1基因缺失的重组拟无枝酸菌
8、以va-f2/va-r2和va-f3/va-r3为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，pcr扩增tyrr1基因的上下游同源臂，同时将所得的两个tyrr1-up-2500和tyrr1-down-2500片段通过assembly试剂盒连接到pkg1132质粒的hindiii/ecori位点，构建得到质粒pkg1132-tyrr1-2500；
9、利用接合转移实验方法，将得到的pkg1132-tyrr1-2500质粒转化到拟无枝酸菌出发菌株中，在有阿伯拉霉素抗性的gym固体培养基上长出的单菌落即为发生同源单交换的菌株；将单交换菌株在无抗gym培养基中进行传代培养，在无抗gym平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为发生同源双交换的菌株，以拟无枝酸菌hm-145基因组为对照，对双交换菌株进行pcr验证，验证正确的即为tyrr1基因缺失的重组拟无枝酸菌；
10、(2)构建整合tyra、arof基因的重组拟无枝酸菌
11、以va-f1/va-r1为引物，pkc1139-perme为模板，pcr扩增perme片段，将perme片段通过assembly试剂盒连接到pset152质粒的pvui/ecorv位点，构建得到质粒pset152-perme；以va-f8/va-r8为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，pcr扩增tyra基因，将tyra片段通过assembly试剂盒连接到pset152-perme质粒的bamhi/nsii位点，构建得到质粒pset152-tyra；以va-f10/va-r10为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，pcr扩增arof基因，将arof片段通过assembly试剂盒连接到pset152-perme质粒的bamhi/nsii位点，构建得到质粒pset152-arof；
12、pset152-arof用xbai和spei酶切，胶回收perme-arof片段，将perme-arof片段通过t4连接酶连接到pset152-tyra的spei位点，构建得到质粒pset152-tyra-arof；pset152-tyra-arof用xbai和spei酶切，胶回收tyra-arof片段，将tyra-arof片段通过t4连接酶连接到pkg1132-tyrr1-2500的spei位点，构建得到质粒pkg1132-tyrr1-tyra-arof；
13、利用接合转移实验方法，将得到的pkg1132-tyrr1-tyra-arof质粒转化到步骤(1)得到的tyrr1基因缺失的重组拟无枝酸菌中，在有阿伯拉霉素抗性的gym固体培养基上长出的单菌落即为发生同源单交换的菌株；将单交换菌株在无抗gym培养基中进行传代培养，在无抗gym平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为发生同源双交换的菌株，以步骤(1)的tyrr1基因缺失的重组拟无枝酸菌基因组为对照，对双交换菌株进行pcr验证，验证正确的即为tyrr1基因缺失并整合tyra-arof基因的重组拟无枝酸菌；
14、(3)构建pyk基因缺失的重组拟无枝酸菌
15、以va-f11/va-r11和va-f12/va-r12为引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.拟无枝酸菌调控蛋白tyrR1基因缺失在提高拟无枝酸菌以葡萄糖为底物发酵产香兰素的香兰素产量重点的应用，所述tyrR1的基因序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质登录号为WP_020416143.1。
2.过表达tyrA-aroF基因在提高拟无枝酸菌以葡萄糖为底物发酵产香兰素的香兰素产量重点的应用，所述tyrA是分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶双功能酶基因，其核酸序列如SEQID NO:2所示，其编码的蛋白质登录号为WP_020419478.1，所述aroF基因是3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶基因，aroF的基因序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的蛋白质登录号为WP_020418838.1。
3.一种高产香兰素产量的重组拟无枝酸菌，所述重组拟无枝酸菌敲除了拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的调控蛋白基因tyrR1和丙酮酸激酶基因pyk，过表达拟无枝酸菌内源的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶双功能酶基因tyrA、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶基因aroF和磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsA
4.根据权利要求3所述的重组拟无枝酸菌，其特征在于基因tyrR1的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，基因tyrA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，基因aroF的核苷酸序列如SEQID NO:3所示，基因pyk的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，基因ppsA的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。
5.权利要求3所述的重组拟无枝酸菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于步骤(1)的拟无枝酸菌出发菌株是拟无枝酸菌HM-145。
7.权利要求3或4所述的重组拟无枝酸菌或根据权利要求5或6所述构建方法得到的重组拟无枝酸菌在产香兰素中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于将所述重组拟无枝酸菌接种于50mL种子培养基M1中，在30C、200rpm条件下培养72h，将种子液按照质量比5％的接种量接种到含有50mL发酵培养基M1的250mL锥形瓶中，在37C、200rpm条件下发酵培养72h。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述M1培养基配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2。
...【技术特征摘要】
1.拟无枝酸菌调控蛋白tyrr1基因缺失在提高拟无枝酸菌以葡萄糖为底物发酵产香兰素的香兰素产量重点的应用，所述tyrr1的基因序列如seq id no:1所示，其编码的蛋白质登录号为wp_020416143.1。
2.过表达tyra-arof基因在提高拟无枝酸菌以葡萄糖为底物发酵产香兰素的香兰素产量重点的应用，所述tyra是分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶双功能酶基因，其核酸序列如seqid no:2所示，其编码的蛋白质登录号为wp_020419478.1，所述arof基因是3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因，arof的基因序列如seq id no:3所示，其编码的蛋白质登录号为wp_020418838.1。
3.一种高产香兰素产量的重组拟无枝酸菌，所述重组拟无枝酸菌敲除了拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)的调控蛋白基因tyrr1和丙酮酸激酶基因pyk，过表达拟无枝酸菌内源的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶双功能酶基因tyra、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof和磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa。
4.根据权利要求3所述的重组拟无枝酸菌，其特征在于基因tyrr1...
【专利技术属性】
技术研发人员：强珊，杨璐，郭建琦，牛永洁，孟永宏，
申请(专利权)人：陕西海斯夫生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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