【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及基因工程，具体的说是涉及一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株构建及其应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、胰蛋白酶(trypsin)是一种丝氨酸蛋白酶，酶解赖氨酸及精氨酸c末端形成的肽键。作为肽键内切酶，起作消化酶作用，在哺乳动物、细菌、真菌等生物体内广泛存在。胰蛋白酶被广泛应用于皮革加工、生物技术、生物医药和食品加工产业。特别是随着细胞免疫治疗与基因治疗、重组胰岛素、抗体生物大分子药物、疫苗以及临床检测技术等领域科研、产业快速发展，胰蛋白酶作为特异性很强的工具酶之一，对其产品质量与产量的需求越来越高，越来越旺盛。猪源胰蛋白酶相比于其他哺乳动物胰蛋白酶，具有①热稳定性强；②无螯合ca2+的中心部位，对+的影响不敏感；③在6对二硫键，断裂1～2个键，均不至于破坏酶分子的完整结构，仍能保持酶活性；④酶活性较高，等等优点，其应用更加广泛，倍受行业关注。
2、传统上胰蛋白酶是从牛、猪、羊的胰脏提取，纯化获得的结晶，再制成的冻干制剂。但传统胰蛋白酶制备存在生产工艺复杂、得率较低、蛋白纯度不均一、酶活性差，酶热稳定性差、不同摇瓶之间产品质量稳定性差、潜在动物源病原微生物污染等等诸多问题，以至于根本不能满足现代生物医药、细胞技术、细胞免疫治疗及临床检验等方面对胰蛋白酶产品质量的需求。利用基因工程技术表达重组胰蛋白酶已有深入且广泛的科学研究以及众多的文献报道，重组胰蛋白酶产品现已成为了市场主流，逐步代替了传统上动物胰脏提取产品。已有专利(赛诺非--安万特德国有限公司，猪胰蛋白酶变体，cn 1119894
3、随着生物技术的不断发展，利用基因工程技术表达重组猪胰蛋白酶已越来越受到人们的青睐。毕赤酵母(pichia pastoris，p.pastoris)又称巴斯德酵母，是一种以甲醇为唯一碳源的甲基营养型酵母菌，既具有原核生物生长特性、操作简单，又具有真核细胞的翻译后修饰加工特性。毕赤酵母作为成熟的蛋白质表达宿主，其生长的细胞密度非常高，具有强大和严格调控的启动子，可使每升培养细胞产生胞内或胞外分泌的重组蛋白量达到克级，已经广泛应用于生物制药和工业酶的生产。毕赤酵母表达体系目前已成功表达了上千种外源蛋白，其中有70种完成商业化生产。国内高等院校或科研机构就毕赤酵母表达外源蛋白方面开展深入或而较全面的研究，但是不同外源蛋白其表达差异还是很大的，特别不同外源蛋白基因来源、蛋白分泌途径不同，蛋白转录后修饰和折叠不同等等差异，都为构建高效表达外源蛋白毕赤酵母菌株提出较高挑战。国内少有关于构建重组猪胰蛋白酶突变体的毕赤酵母表达菌株专利，但鲜有关于构建高效表达猪胰蛋白酶毕赤酵母表达菌株的科研文献或专利报道。同时在已开展的重组猪胰蛋白酶毕赤酵母表达的科研或制备应用过程中，仍存在有①酶蛋白表达量不高，增加分离纯化难度，提升整体生产成本；②胰蛋白酶原表达过程中不能正确折叠，或二硫键形成差错，造成细胞内质网压力，导致宿主细胞死亡；③重组胰蛋白酶活性低，不同批次之前质量不稳定；等等问题。因此，构建一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，用于高效、稳定、低成本地制备高酶活性的重组猪胰蛋白酶，对于促进重组猪胰蛋白酶工业化生产，满足现代生物医药、细胞技术、免疫治疗及临床检验等对胰蛋白酶产品质量和产量的需求具有很重要意义。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株构建及其应用。以毕赤酵母gs115为宿主细胞，通过对毕赤酵母表达密码子偏好性分析和dna核酸分子二级结构稳定分析，进行野生型猪胰蛋白酶基因核酸序进行密码子优化，结合多拷贝数基因筛选，以及共表达分子伴侣内质网蛋白erp44、酿酒酵母a交配因子前导肽(a-mf)等基因工程技术手段，构建一种表达重组猪胰蛋白酶的毕赤酵母菌株，从而提升重组猪胰蛋白酶分泌表达量、提高重组猪胰蛋白酶的酶活性和稳定性，减少不同摇瓶之间质量差异，降低重组猪胰蛋白酶工业化生产成本。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案，
3、1、根据毕赤酵母表达密码子偏好性和dna核酸分子二级结构稳定性，结合野生型猪胰蛋白酶基因核酸序列gc含量水平，对在毕赤酵母表达的重组猪胰蛋白酶基因核酸序列进行了优化，将l(leu)、s(ser)、g(gly)、v(val)、n(asn)、p(pro)、q(gln)以及a(ala)的密码子分别优化为ttg、agt、ggt、gtt、aat、cca、caa以及gct；优化后猪胰蛋白酶基因cdna序列，如seq idno.1所示；
4、2、改变猪胰蛋白酶基因序列中g+c碱基含量(野生型含量为53.4％)，根据毕赤酵母表达密码子选择性特征以及dna核酸分子二级结构稳定性要求，将步骤1优化后猪胰蛋白酶cdna序列中g+c碱基含量控制在43％～48％范围内；
5、3、将步骤2优化后猪胰蛋白酶基因和酿酒酵母a交配因子前导肽(a-mf)(或毕赤酵母表达体系公知的、非专利权属的其他信号肽)的基因插入质粒ppic9k(或毕赤酵母表达体系公知的、非专利权属的其他质粒)中aox1启动子的下游，且猪胰蛋白酶基因于酿酒酵母a交配因子前导肽(a-mf)基因下游，构建重组质粒ppic9k-αmf-tps。
6、酿酒酵母a交配因子前导肽(a-mf)选自于人源内质网蛋白erp44(endoplasmicreticulum protein44)基因，其核酸序列和氨基酸序列如seq id no.2所示。
7、本专利技术提到的酿酒酵母a交配因子前导肽(a-mf)、质粒ppic9k、质粒pgapza等均已属于毕赤酵母表达体系科学文献公开报道的公知技术，本专利技术直接引用，不作权利要求，也不存在侵犯知识产权。
8、利用所述的高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，利用公知的基因工程重组技术，将构建的重组质粒ppic9k-αmf-tps和重组质粒pgapza-herp44，酶切后线性化电转导入毕赤酵母gs115(购于thermofisher)感受态细胞内，经过抗性筛选得到重组猪胰蛋白酶表达毕赤酵母菌株，命名为yj-gs-tps菌株。
9、进一步地利用公知的转化后介导载体扩增法，在不同质量浓度遗传霉素g418 ypd培本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，其特征在于，具体的构建步骤为，
2.一种权利要求1所述的高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株的应用，其特征在于，利用所述的高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，利用公知的基因工程重组技术，将构建的重组质粒pPIC9K-αMF-TPS和重组质粒pGAPZA-hERp44，酶切后线性化电转导入毕赤酵母GS115感受态细胞内，经过抗性筛选得到重组猪胰蛋白酶表达毕赤酵母菌株，命名为YJ-GS-TPS菌株；
【技术特征摘要】
1.一种高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，其特征在于，具体的构建步骤为，
2.一种权利要求1所述的高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株的应用，其特征在于，利用所述的高效表达猪胰蛋白酶重组毕赤酵母菌株，利用公知的基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：喻长杰，胡辉，李长泽，
申请(专利权)人：引加上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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