【技术实现步骤摘要】
一种液态产孢的黑曲霉工程菌株及其构建方法和应用
[0001]本申请属于生物工程
，尤其涉及一种液态产孢的黑曲霉工程菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
[0002]柠檬酸的工业生产菌种一般为黑曲霉和酵母菌，其中，黑曲霉的孢子再生能力强，能够保证发酵中的有效菌充足，并且可以利用淀粉等廉价可再生碳源作为原料，从而成为工业生产柠檬酸的最佳微生物之一。
[0003]相关技术中，黑曲霉发酵生产一般都需要接种大量的无性分生孢子以使生物量快速地提高，从而为后续的产酶和产酸搭建细胞平台。
[0004]但是，黑曲霉作为一种子囊菌只能在固态介质且氧暴露环境下进行无性产孢，需要花费大量的时间和精力进行培养基的配制、接种、孢子收集等准备工作，使得黑曲霉发酵生产的工作量大、耗时耗力且成本高，不利于工业化生产。
技术实现思路
[0005]本申请的目的在于提供一种液态产孢的黑曲霉工程菌株及其构建方法和应用，旨在解决现有黑曲霉菌株只能固态产孢，以及固态产孢造成的发酵生产工作量大、耗时耗力且成本高的技术问题。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种液态产孢的黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述黑曲霉工程菌株包括以原始黑曲霉为模板，使所述原始黑曲霉中的brlA基因的原始启动子原位替换为木糖诱导启动子Pxylp；其中，所述brlA基因的基因ID为ASPNIDRAFT2
_
1171592；所述木糖诱导启动子Pxylp的基因ID为PCH
_
Pc20g07020。2.一种液态产孢的黑曲霉工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：S1：合成黑曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；S2：对所述黑曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株导入pFC330质粒，合成组成型表达Cas9的黑曲霉背景菌株；S3：对所述黑曲霉背景菌株的基因brlA启动子区域设计sgRNA打靶点，并为所述sgRNA打靶点序列设计上游引物T7
‑
brlA
‑
F和下游引物sgRNA
‑
R；利用PCR高保真酶以及所述上游引物T7
‑
brlA
‑
F和所述下游引物sgRNA
‑
R从pX330质粒中扩增合成sgRNA的双链DNA模板之后，利用RNA体外转录试剂盒转录为对应的sgRNA，其中，所述sgRNA打靶点的核苷酸序列为5
’‑
CCGTTGCGCCTTGCCACATTCC
‑3’
；所述T7
‑
brlA
‑
F含有T7启动子和特异性sgRNA打靶序列，所述T7
‑
brlA
‑
F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；所述sgRNA
‑
R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示；S4：将hph基因片段克隆到载体pEasy
‑
BluntZero的product位点合成载体P
‑0‑
hph，并将Pxylp启动子序列克隆到所述载体P
‑0‑
hph的Not1位点合成P
‑0‑
hph
‑
Pxylp；将所述P
‑0‑
hph
‑
Pxylp转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并接种于含有氨苄青霉素的LB培养皿中过夜培养之后，挑取单克隆并经菌落PCR验证，获得brlA控制表达质粒P
‑0‑
hph
‑
Pxylp；再以所述质粒P
‑0‑
hph
‑
Pxylp为模板，通过PCR扩增出含有微同源臂的修复模板hph
‑
Pxylp，其中，所述hph基因的基因ID为CP059254.1；S5：对所述黑曲霉背景菌株共转入所述sgRNA和所述hph
‑
Pxylp，并在不含木糖的转化培养基中培养4天之后，挑取不产生分生孢子的白色转化子菌丝转接于PDA培养基中继续培养4天，经诊断PCR证明hph
‑
Pxylp正确整合在brlA的启动子区域；S6：将正确整合的所述白色转化子菌丝接种至含有尿苷、尿嘧啶和5
‑
FOA的PDA固态培养基中孵育7天，获得不含pFC330质粒的尿嘧啶缺陷型产孢改造菌株，并对所述尿嘧啶缺陷型产孢改造菌株整合回补pyrG基因片段，即得液态产孢的黑曲霉工程菌株。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述黑曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的合成方法包括：S11：将含有Cas9基因的pFC332质粒转入原始黑曲霉菌株，并经hph筛选获得Cas9携带转化子；S12：以所述Cas9携带转化子为出发菌株设计pyrG敲除sgRNA并体外合成之后，敲除所述Cas9携带转化子中的pyrG基因，再经5
‑
FOA筛选获得pyrG敲除转化子，其中，所述pyrG基因的基因ID为XM
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001395395.2。S13：将所述pyrG敲除转化子在不含hph的PDA培养基中进行培养，得到p...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，张婷婷，张驰，徐晴，薛锋，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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