【技术实现步骤摘要】
一种通过敲除转录因子促进生产
β
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胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株、方法和应用
[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其是一种通过敲除转录因子促进生产β
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胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株、方法和应用。
技术介绍
[0002]裂殖壶菌(Schiochytrium sp.)作为一种海洋单细胞异养微生物。因其底物谱广泛，生长速度快且脂质含量高逐渐成为受研究者追捧的优良宿主细胞。目前，裂殖壶菌通过培养条件的优化，可实现其脂质积累量达到干重细胞(DCW)的55％以上。此外，裂殖壶菌天然还存在甲羟戊酸(MVA)途径。因此，裂殖壶菌可利用MVA途径生产萜类化合物。
[0003]β
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胡萝卜素(C
40
H
56
)作为一类四萜化合物，其常见于许多植物、真菌和藻类。在人体内，β
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胡萝卜素是维生素A的前体物质。微生物A对于抗癌、抗氧化和抗心血管疾病起着至关重要的作用。2020年全球β
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胡萝卜素市场达到4...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种通过敲除转录因子促进生产β
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胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株是通过分别敲除裂殖壶菌HX
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308基因组上转录因子A1189基因、A9257基因获得的，实现在细胞水平对裂殖壶菌代谢流的全局调控，促进裂殖壶菌β
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胡萝卜的积累；其中，A1189基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，A9257基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.2。2.根据权利要求1所述的裂殖壶菌工程菌株，其特征在于：所述裂殖壶菌HX
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308的保藏编号为CCTCCNo.M209059。3.根据权利要求1或2所述的裂殖壶菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株为裂殖壶菌
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A1189和
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A9257的工程菌株，裂殖壶菌
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A1189、
△
A9257的工程菌株相较于野生型裂殖壶菌HX
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308的β
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胡萝卜素滴度分别提高1.3倍、3.9倍。4.如权利要求1至3任一项所述的裂殖壶菌工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据裂殖壶菌HX
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308基因组测序，获得启动子P2845，终止子T2845，基因A1189和A9257上下游同源臂序列A1189up、A1189dw、A9257up、A9257dw；G418抗性基因NeoR，NeoR的序列为SEQ ID NO.3所示，设计引物，通过PCR获得相应的DNA片段，进一步通过PCR获得融合DNA片段；其中，启动子P2845的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，终止子T2845的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，A1189up的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，A1189dw的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，A9257up的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，A9257dw的核苷酸序列为SEQ ID NO.10；(2)通过一步克隆方法将获得的融合DNA片段插入pZPK载体，构建用于敲除A1189基因和A9257基因的重组质粒ZL
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A1189和ZL
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A9257，并将其转入大肠杆菌DH5α；(3)通过对大肠杆菌转化子测序，获得正确的重组质粒，保菌，备用；(4)将测序正确的重组质粒，转入农杆菌AGL
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1，获得重组农杆菌ZL
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A1189和ZL
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A9257菌株；(5)借助农杆菌介导裂殖壶菌转化方法，实现裂殖壶菌基因组上A1189基因和A9257基因的敲除，获得裂殖壶菌
△
A1189和
△
A9257的工程菌株。5.根据权利要求4所述的裂殖壶菌工程菌株的构建方法，其特征在于：具体包括如下步骤：(1)重组质粒ZL
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A1189、ZL
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A9257的构建：以裂殖壶菌HX
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308基因组为模板，分别使用P2845
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F/R，T2845
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F/R，A1189UP
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F/R，A1189DW
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F/R，A9257UP
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F/R，A9257DW
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F/R引物对进行PCR扩增；同时，以pZPK质粒为模板，使用G418
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F/R引物对进行PCR扩增；最终获得启动子P2845，终止子T2845，G418抗性基因NeoR，A1189和A9257上下游同源臂DNA片段；其中，P2845
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F/R、T2845
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F/R、G418
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F/R、A1189UP
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F/R、A1189DW
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F/R、A9257UP
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F/R、A9257DW
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F/R的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.11
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24；以pZPK质粒为骨架，使用核酸内切酶EcoRI和HindIII对pZPK进行双酶切，胶回收获得线性化载体；使用试剂盒进行一步克隆，将上一步获得的融合DNA片段插入p...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，孙小曼，闫春晓，郭东升，马旺，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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