一种Griffithsin突变体及其应用制造技术

本发明专利技术旨在提供一种Griffithsin突变体，通过对Griffithsin进行突变，显著提高了GRFT对于病毒的抑制活性，突变体1 GRFT

【技术实现步骤摘要】
一种Griffithsin突变体及其应用

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本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种Griffithsin突变体及其应用。

技术介绍
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近年来，随着经济的发展，生活水平逐渐提升，越来越多的人开始饲养宠物，其中猫因其可爱属性，获得了许多宠爱。然而，猫传染性腹膜炎(feline infectious peritonitis，FIP)是宠物猫中常见的病症，猫传染性腹膜炎是一种渐进性、高致死性疾病，可发生在以幼猫和老年猫为主的各年龄段家猫。FIPV病毒常由携带者随粪便传染至同群猫，少数可经衣服、食皿、寝具、昆虫等途径传播。该病主要多发于2岁以下猫群中，早期病症不明显，可能出现食欲消退、精神差、体重下降、持续发热、贫血等症状，后期主要表现为湿型传染性腹膜炎(渗出型)和干型传染性腹膜炎(非渗出型)两种类型，其中约有80％的湿性FIP病例是由于血管发生病变而导致的渗出液，而干性FIP是由于肉芽肿所形成的肿块，某些FIP病例两者均有。患有FIP的病猫通常会出现嗜睡、发热、厌食、体重减轻、生长受阻、淋巴结肿大等症状，可能还会出现黄疸、呼吸急促、呼吸困难和腹胀等症状，应用抗生素或非甾体类抗炎药物进行治疗通常没有效果。湿性FIP渗出液可见于腹腔、胸腔或心包，偶见公猫整个阴囊内，病情通常在几天或几周内进展迅速，严重危害病猫生命。
[0003]FIP的病原为猫冠状病毒(FCoV)，与犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)以及猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TEGV)同属于冠状病毒亚科α冠状病毒属，是有包膜的单股正链RNA病毒。基于临床症状及产生的病理变化不同，FCoV分为猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和猫肠道冠状病毒(FECV)两个生物型。FECV在猫肠道中普遍存在，通常导致患猫出现轻微的肠道症状，一般能够自愈，死亡率低；而FIPV是猫传染性腹膜炎的主要病原，其主要引起幼猫死亡，具有较高的死亡率。FIPV在分类上属于套式病毒目(Nidovirus)冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链、不分节段的RNA病毒。
[0004]猫传染性腹膜炎难以治愈，目前尚无有效的药物预防或治疗猫传染性腹膜炎，猫一旦发病，100％的致死率和高昂的治疗费用，给宠物主人带来极大的经济损失和心理压力。目前报道的核苷类似物GS
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441524对FIP的疗效和安全性较好，但仍有治疗后复发的病例，因而研究对于猫传染性腹膜炎具有预防和/或治疗的药物对于该病的控制、宠物产业的持续发展具有重要的意义。
[0005]Griffithsin
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也称作GRFT
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是一种最初从红藻中分离的蛋白质，它结合在I型人类免疫缺陷病毒(HIV
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1)表面发现的N
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连接的聚糖的甘露糖末端残基，HIV
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2和其它包膜病毒，包括丙型肝炎病毒(HCV)，严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
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CoV)等，其活性也已经在NIPAH，EBOLA病毒中得到证实。

技术实现思路
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基于目前Griffithsin的研究情况，本专利技术旨在提供一种Griffithsin突变体，并探索其在抑制FIPV病毒增殖中的应用，并进一步探索其在制备治疗FIP中的应用。
[0007]本专利技术采用如下技术方案：一种Griffithsin突变体GRFT
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MU1，其特征在于，所述Griffithsin突变体GRFT
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MU1的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
[0008]本专利技术还请求保护所述Griffithsin突变体GRFT
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MU1在制备预防和/或治疗猫传染性腹膜炎的药物中的应用。
[0009]所述药物为注射制剂，其用量为1
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5mg/kg体重。
[0010]所述药物可以有效抑制FIPV在细胞中的增殖。
[0011]所述药物可以减少FIP病猫的腹水量。
[0012]基于Griffithsin突变体GRFT
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MU1具有良好的预防和治疗功效，本专利技术还请求保护所述Griffithsin突变体GRFT
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MU1在制备宠物食品中的应用。
[0013]所述食品优选为保健食品，更优选为用于康复后的FIP病猫。
[0014]基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术旨在提供一种Griffithsin突变体，通过对Griffithsin中三个GGS片段进行突变，将其突变为GGA，显著提高了GRFT对于病毒的抑制活性，突变体1GRFT
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MU1相对原始的griffithsin表现出更高的抑制活性，当其浓度降至20nM时，仍然保持50％以上的病毒增殖抑制率，且动物实验表明，其相对原始的Griffithsin具有更好的治疗效果。
附图说明：
图1.猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)导致的细胞病变图，其中1为空白对照；2
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6为接毒后的细胞病变，V指向细胞病变。
[0016]图2：猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的鉴定，泳道M为marker；1和2为分离的病毒PCR扩增结果。
[0017]图3：Griffithsin及其突变体对FIPV在细胞中的增殖抑制作用。
具体实施方式：
实施例1.猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的分离与鉴定1.病料及细胞：猫传染性腹膜炎病料由陕西诺威利华生物科技有限公司采集和提供，具体是将猫传染性腹膜炎抗原试纸条检测出阳性且为自然发病猫的腹水，4℃，12000g离心10min，在超净台中取上清经0.22μm滤器过滤除菌后，将上清样品分装于灭菌的1.5mL EP管中，放于
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80℃超低温冰箱备用。
[0019]CRFK细胞购自ATCC。
[0020]2.猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)病毒的分离：2.1 CRFK细胞的培养将CRFK细胞冻存管从
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80℃冰箱迅速取出后，复苏，轻轻晃动，使细胞均匀分布于细胞瓶底部，在含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养，约12h，细胞已经贴壁，并且维持细胞正常生长形态，当细胞基本长满单层后进行传代培养。
[0021]2.2病毒的分离：待CRFK在T25细胞瓶中培养至铺满单层后，弃去旧的培养基，消化，加入适量无血
清培养基重悬，1000g离心10min，弃上清，再用无血清培养基洗一遍，最后再次用适量无血清培养基重悬，细胞计数调整其密度为1*106个/mL，然后将细胞重悬液和离心过滤后的FIP阳性腹水样品按照10:1的比例，每株接种于六孔板中，并设置正常细胞对照，所有孔保持胰蛋白酶浓度为10ug/mL，最终将六孔板置于细胞培养箱中培养，每天观察细胞生长状况和细胞病变情况。若无病变，则于第三天收取细胞和细胞上清盲传四代，若第四代仍然无细胞病变，则判定其为阴性。有出现的在细胞病变的毒株本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Griffithsin突变体GRFT
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MU1，其特征在于，所述Griffithsin突变体GRFT
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MU1的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。2.根据权利要求1所述的Griffithsin突变体GRFT
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MU1在制备预防和/或治疗猫传染性腹膜炎的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为注射制剂，其用量为1

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，陈瑞，王昆，
申请(专利权)人：武汉华腾济康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：