一种PE/荧光串联染料及其制备方法与标记抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种PE/荧光串联染料及其制备方法与标记抗体的方法，对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理；再进行小分子有机染料串联处理；然后对获得的串联染料进行蛋白保护处理；最后采用交联剂进行活化处理；得到一种PE/荧光串联染料。进行抗体标记时，先采用还原剂对目标抗体进行巯基化处理；再将巯基化的目标抗体与活化后的串联染料进行交联；然后向交联完成的串联染料

【技术实现步骤摘要】
一种PE/荧光串联染料及其制备方法与标记抗体的方法


[0001]本专利技术属于免疫学
，具体涉及一种藻红蛋白串联荧光染料的制备方法及这种串联染料标记抗体的方法。

技术介绍

[0002]藻红蛋白(P
‑
phycoerythrin，简称PE)是从红藻中分离纯化获得的、目前普遍使用的一种蛋白类荧光染料。与其他藻胆蛋白一样，在特定波长激发下，藻红蛋白能发射强烈的荧光，其荧光强度是荧光素的30
‑
100倍，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有较宽的激发及发射范围。藻红蛋白及其串联染料是在流式细胞术中被广泛应用的重要荧光蛋白。现有技术中常常采用将藻红蛋白及其串联染料与抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白等物质结合，制成荧光探针的方式，通过检测其发出的荧光，来进行多色荧光分析、细胞表面抗原检测、蛋白质或核酸等生物大分子的分析等，通常应用于荧光显微镜和流式细胞仪等免疫荧光检测平台。但是现有藻红蛋白串联染料标记抗体的标记效率低，易造成抗体变性，使用时阴性阳性组的分离度差，且阳性组荧光强度弱。

技术实现思路

[0003]本专利技术属于免疫学
，具体涉及一种藻红蛋白串联荧光染料的制备方法及这种串联染料标记抗体的方法。
[0004]本专利技术采用如下技术方案：一种PE/荧光串联染料，其制备方法包括如下步骤：（1）将巯基封闭的藻红蛋白与小分子有机染料反应，得到染料/PE；（2）将染料/PE上的羧基活化后与稳定剂反应，得到稳定性染料/PE；（3）将稳定性染料/PE与交联剂反应，得到PE/荧光串联染料。
[0005]本专利技术公开了一种流式抗体标记试剂盒，包括上述PE/荧光串联染料，还包括抗体修饰剂、抗体保存液、滤管等。
[0006]本专利技术公开了利用上述PE/荧光串联染料标记抗体的方法，将上述PE/荧光串联染料与巯基化的抗体反应，完成抗体的标记。
[0007]本专利技术公开了上述PE/荧光串联染料或者上述PE/荧光串联染料标记抗体在制备荧光探针中的应用。
[0008]本专利技术对藻红蛋白上的游离巯基作封闭处理；再进行小分子有机染料串联处理；然后对获得的串联染料进行蛋白保护处理；最后采用交联剂进行活化处理；得到一种PE/荧光串联染料。进行抗体标记时，先采用还原剂对目标抗体进行巯基化处理；再将巯基化的目标抗体与活化后的串联染料进行交联；然后向交联完成的串联染料
‑
抗体体系中加入封闭剂进行染料封闭处理，并保存荧光抗体，完成抗体标记。
[0009]本专利技术中，利用封闭剂将藻红蛋白的巯基封闭，得到巯基封闭的藻红蛋白；封闭剂、藻红蛋白的摩尔比为1∶（50～80）；封闭时的反应温度为0～35℃、时间为1～25小时，比
如，封闭时的反应温度为15～35℃、时间为1～3小时，或者封闭时的反应温度为4℃、时间为10～20小时。封闭反应结束后进行常规超滤处理。
[0010]本专利技术中，巯基封闭的藻红蛋白与小分子有机染料的摩尔比为1∶（10～30）；巯基封闭的藻红蛋白与小分子有机染料反应的温度为15～35℃、时间为10～60分钟。反应结束后进行常规超滤处理。
[0011]本专利技术中，采用EDC、NHS将染料/PE上的羧基活化；染料/PE、稳定剂的用量比例为（2.5～5）g∶（0.1～1）mol；羧基活化后的染料/PE与稳定剂反应时，反应温度为0～35℃、时间为1～25小时，比如，羧基活化后的染料/PE与稳定剂反应时，反应温度为15～35℃、时间为1～5小时，或者反应温度为4℃、时间为10～20小时。封闭反应结束后进行常规超滤处理。
[0012]本专利技术中，稳定性染料/PE与交联剂的摩尔比为1∶（20～80）；反应的温度为15～35℃、时间为0.5～4小时。反应结束后进行常规超滤处理。
[0013]本专利技术中，利用还原剂与抗体反应，得到巯基化的抗体；反应的温度为15～35℃、时间为1～5小时。反应结束后进行常规超滤处理。
[0014]本专利技术中，PE/荧光串联染料与巯基化的抗体的摩尔比为（0.5～5）∶1；反应的温度为15～35℃、时间为2～6小时。优选的，巯基化的抗体的浓度为0.5～5mg/mL。优选的，PE/荧光串联染料与巯基化的抗体反应结束后加入封闭剂，15～35℃反应0.5～2小时，完成抗体的标记，直接用于荧光检测。
[0015]本专利技术涉及的原料包括抗体、小分子有机染料、藻红蛋白、防腐剂、稳定剂、交联剂、还原剂、封闭剂和缓冲液，其中，所述小分子有机染料为YF568、YF594、Texas Red、YF620、YF647、YF680、YF750、Cy5、Cy5.5和Cy7等罗丹明染料或菁染料中的任意一种；所述防腐剂为NaN3、Proclin系列任意一种，用于抗体保存液；所述稳定剂为氨基化合物（可选蛋白质或多肽，如牛血清白蛋白BSA、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甘丙肽、甘精肽、丙甘肽、甘丙丝肽等）、糖醇（如山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇等）、海藻糖、明胶、甘油、聚乙二醇聚合物（如PEG300、PEG400、PEG600、PEG4000、PEG10000，PEG20000等）、NaCl和EDTA任意一种或多种组合；所述交联剂为SMCC（琥珀酰亚胺 4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸盐）、Sulfo
‑
SMCC（磺基琥珀酰亚胺 4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸盐）、LC
‑
SMCC（4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧基
‑
(6
‑
氨基己酸)）、SM(PEG)2（聚乙二醇化SMCC交联剂）、SM(PEG)4（聚乙二醇化SMCC交联剂）、SM(PEG)6（聚乙二醇化，长链SMCC交联剂）、SM(PEG)8（聚乙二醇化，长链SMCC交联剂）、SM(PEG)
12
（聚乙二醇化，长链SMCC交联剂）、SM(PEG)
24
（聚乙二醇化，长链 SMCC交联剂）、SMPB（琥珀酰亚胺基4
‑
(p
‑
马来酰亚胺基苯基)丁酸酯）、AMAS（N
‑
α
‑
马来酰亚胺基乙酰
‑
氧基琥珀酰亚胺酯）、GMBS（N
‑
γ
‑
马来酰亚胺基丁酰
‑
氧琥珀酰亚胺酯）、MBS（m
‑
马来酰亚胺基苯甲酰
‑
N
‑
羟基琥珀酰亚胺酯）、EMCS（N
‑
ε
‑
马来酰亚胺基己酰
‑
氧琥珀酰亚胺酯）、BMPS（N
‑
β
‑
马来酰亚胺基丙基
‑
氧琥珀酰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PE/荧光串联染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： （1）将巯基封闭的藻红蛋白与小分子有机染料反应，得到染料/PE； （2）将染料/PE上的羧基活化后与稳定剂反应，得到稳定性染料/PE； （3）将稳定性染料/PE与交联剂反应，得到PE/荧光串联染料。2.根据权利要求1所述PE/荧光串联染料的制备方法，其特征在于，利用封闭剂将藻红蛋白的巯基封闭，得到巯基封闭的藻红蛋白；封闭剂、藻红蛋白的摩尔比为1∶（50～80）；封闭时的反应温度为15～35℃、时间为1～3小时，或者封闭时的反应温度为0～5℃、时间为10～20小时；巯基封闭的藻红蛋白与小分子有机染料的摩尔比为1∶（10～30）；巯基封闭的藻红蛋白与小分子有机染料反应的温度为15～35℃、时间为10～60分钟；所述小分子有机染料为罗丹明染料或菁染料中的任意一种；所述封闭剂为NEM、MEA、半胱胺盐酸盐任意一种或多种组合。3.根据权利要求1所述PE/荧光串联染料的制备方法，其特征在于，采用EDC、NHS将染料/PE上的羧基活化；染料/PE、稳定剂的用量比例为（2.5～5）g∶（0.1～1）mol；羧基活化后的染料/PE与稳定剂反应时，反应温度为15～35℃、时间为1～5小时，或者反应温度为0～5℃、时间为10～20小时；所述稳定剂为氨基化合物、糖醇、海藻糖、明胶、甘油、聚乙二醇聚合物、NaCl和EDTA任意一种或多种组合。4.根据权利要求1所述PE/荧光串联染料的制备方法，其特征在于，稳定性染料/PE与交联剂的摩尔比为1∶（20～80）；反应的温度为15～35℃、时间为0.5～4小时；所述交联剂为SMCC、Sulfo
‑
SMCC、LC
‑
SMCC、SM(PEG)2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱海霞，钱近春，夏继波，
申请(专利权)人：苏州优逸兰迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：