一种别藻蓝蛋白荧光串联染料及其制备方法与偶联抗体的方法技术

本发明专利技术涉及免疫学技术领域，具体涉及一种荧光蛋白串联染料及其偶联单克隆抗体标记方法以及试剂盒。由两种荧光分子组成，将大分子蛋白染料APC作为供体、小分子有机染料为受体，两者通过共价键结合。该串联染料结合后，供体染料APC可以被激发器发出的激光激发，而小分子受体染料却不能。供体染料APC被激发后发射出的能量转移至受体染料，使受体染料激发出特定波长的光线。该串联染料具有供体染料APC的激发光谱和小分子受体染料的发射光谱，成为与供体染料APC和受体染料完全不同的独特荧光染料且具备比较大的斯托克位移。料且具备比较大的斯托克位移。料且具备比较大的斯托克位移。

【技术实现步骤摘要】
一种别藻蓝蛋白荧光串联染料及其制备方法与偶联抗体的方法


[0001]本专利技术涉及免疫学
，具体涉及一种别藻蓝蛋白与荧光染料串联形成串联染料的方式，以及串联染料偶联抗体的方法。

技术介绍

[0002]藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻等藻类中的捕光色素蛋白，是多亚基组成的蛋白复合物。藻胆蛋白共价结合一个或多个藻胆色素，具有很强的荧光，可以作为荧光探针用于免疫荧光检测。由于免疫荧光技术相较于放射免疫、酶联免疫等其他免疫标记技术灵敏度高且安全无毒，成为研究的热点。
[0003]免疫荧光技术又被称为荧光抗体探针技术，荧光抗体是用荧光染料标记抗体，制成的荧光标记抗体溶液，用荧光标记的抗体和特异性抗原发生抗原
‑
抗体特异性反应，利用荧光显微镜技术可以非常灵敏的观察抗原
‑
抗体复合物在组织内的分布情况，利用流式细胞技术可以分析特定抗原的表达情况。
[0004]但是在大多数情况下，荧光测定的检测限值常受到血清和其他生物样品中本底荧光的影响，以血清为例，400
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600 nm波段的本底荧光与常用的荧光标记物（如FITC）的荧光发射光谱相重叠，干扰过大，会影响检测的敏感性。

技术实现思路

[0005]本专利技术将荧光蛋白与小分子染料串联，使得该荧光蛋白串联染料的斯托克位移明显增大，这使得该串联染料在近红外成像技术上具有背景干扰低、对生物样本点的穿透性强、检测灵敏度高等优点。具体的，本专利技术提供了一种别藻蓝蛋白APC与小分子染料偶联所得的串联染料，它由两种荧光分子组成，将大分子蛋白染料APC作为供体、小分子有机染料为受体，两者通过共价键结合。该串联染料结合后，供体染料APC可以被激发器发出的激光激发，而小分子受体染料却不能。供体染料APC被激发后发射出的能量转移至受体染料，使受体染料激发出特定波长的光线。该串联染料具有供体染料APC的激发光谱和小分子受体染料的发射光谱，成为与供体染料APC和受体染料完全不同的独特荧光染料且具备比较大的斯托克位移。
[0006]本专利技术采用如下技术方案：一种别藻蓝蛋白荧光串联染料，其制备方法为，将别藻蓝蛋白与交联剂反应，然后与小分子染料反应，得到别藻蓝蛋白荧光串联染料。
[0007]一种别藻蓝蛋白荧光串联染料偶联抗体的方法，包括以下步骤，将别藻蓝蛋白与交联剂反应，然后与小分子染料反应，得到别藻蓝蛋白荧光串联染料；然后将别藻蓝蛋白荧光串联染料与修饰抗体进行偶联，完成别藻蓝蛋白荧光串联染料偶联抗体。
[0008]现有技术需要先将荧光蛋白进行保护，再将荧光蛋白与染料串联制备成串联染料，接着再用交联剂交联后与修饰过的抗体进行偶联。本专利技术采用不同的技术思路，先使用
交联剂直接交联荧光蛋白，再与小分子染料串联，最后与修饰后的抗体进行偶联。本专利技术对比原有技术，省略了串联染料的后续处理步骤，避免了串联染料本身不稳定的降解，同时反应条件简化，反应效率得到了极大的提高。
[0009]本专利技术中，将别藻蓝蛋白与交联剂反应，再引进氨基，然后与小分子染料反应，得到别藻蓝蛋白荧光串联染料。具体的，将别藻蓝蛋白与交联剂反应，然后活化羧基，再引进氨基，然后与小分子染料反应，得到别藻蓝蛋白荧光串联染料。优选的，利用EDC活化羧基，利用双甘肽引入氨基；进一步优选的，别藻蓝蛋白的反应浓度为5mg/ml，双甘肽的工作浓度为5
‑
50 mM，保留氨基反应位点，不会影响后续小分子染料与NHS酯上的氨基结合效率，同时对别藻蓝蛋白起稳定作用。
[0010]本专利技术中，交联剂用量为别藻蓝蛋白APC摩尔量的30～100当量优选30～50当量，交联剂为异型双功能键交联剂；优选的，采用SPDP（3
‑
(2
‑
吡啶二巯基)丙酸N
‑
羟基琥珀酰亚胺酯）及其类似物或者SMCC（琥珀酰亚胺 4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸盐)及其类似物作为异型双功能键交联剂，定向偶联荧光蛋白APC上的氨基位点，同时荧光蛋白APC上的羧基位点得以活化，而偶联剂上的马来酰亚胺基团端得以保留，与还原后的单克隆抗体IgG的巯基端定向偶联，实现了单克隆抗体与荧光蛋白
‑
小分子串联染料的定向偶联，提高了荧光蛋白串联染料与单克隆抗体反应的特异性。
[0011]本专利技术中，修饰抗体为利用还原剂修饰抗体。优选的，还原剂优选为新型生物还原剂，二硫代氨基烷，譬如(S)
‑2‑
氨基丁烷
‑
1,4
‑
二硫醇盐酸盐（DTBA），也称为二硫代丁胺，3
‑
氨基戊烷
‑
1,5
‑
二硫醇盐酸盐，2,3
‑
二氨基丁烷
‑
1,4
‑
二硫醇盐酸盐等，此类还原剂具有比其他常用还原试剂更高的性能。与常用的二硫苏糖醇DTT、2
‑
巯基乙醇BME等相比，此类还原剂的还原速度比DTT还原小分子二硫化物快3～5倍。同时，鉴于还原剂本身结构特性，二硫代氨基烷修饰好的抗体可保存7天左右，而DTT、BME等还原后的抗体只能维持1～3天。
[0012]本专利技术的目的在于提供一种别藻蓝蛋白（APC）与荧光染料连接形成串联染料的方法，同时将这种串联染料应用的标记抗体，形成生产APC串联染料标记抗体的综合方案，这种抗体即可用于免疫荧光检测，又可用于流式细胞仪。涉及原料包括抗体（优选单克隆抗体）、别藻蓝蛋白（优选液体溶液形式）、小分子荧光染料、交联剂、还原剂、稳定剂、缓冲液等多种。具体涉及包括单克隆抗体（IgG）；荧光蛋白（APC）；小分子染料，比如Sulfo
‑
cy7 SE、Sulfo
‑
cy5.5 SE、YF750 SE等类似的小分子荧光染料；交联剂Sulfo
‑
SMCC（4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）、SMCC、或者SMCC的类似物，诸如GMBS （4
‑
Maleimidobutyric acid N
‑
hydroxysuccinimide ester，N
‑
γ
‑
马来酰亚胺基丁酰
‑
氧琥珀酰亚胺酯）、5
‑
Maleimidovalericacid
‑
NHS（5
‑
马来酰亚胺基戊酸
‑
NHS）、N
‑
Succinimidyl 6
‑
maleimidohexanoate（6
‑
(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯）、 LC
‑
SPDP (succinimidyl 6
‑
(3(2
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种别藻蓝蛋白荧光串联染料的制备方法，其特征在于，将别藻蓝蛋白与交联剂反应，然后与小分子染料反应，得到别藻蓝蛋白荧光串联染料。2.根据权利要求1所述别藻蓝蛋白荧光串联染料的制备方法，其特征在于，将别藻蓝蛋白与交联剂反应，再引进氨基，然后与小分子染料反应，得到别藻蓝蛋白荧光串联染料；交联剂用量为别藻蓝蛋白摩尔量的30～100当量，交联剂为异型双功能键交联剂。3.根据权利要求2所述别藻蓝蛋白荧光串联染料的制备方法，其特征在于，将别藻蓝蛋白与交联剂反应，然后活化羧基，再引进氨基，然后与小分子染料反应，得到别藻蓝蛋白荧光串联染料；采用SPDP或其类似物，或者SMCC或其类似物作为异型双功能键交联剂。4.根据权利要求1所述别藻蓝蛋白荧光串联染料的制备方法制备的别藻蓝蛋白荧光串联染料。5.利用权利要求4所述别藻蓝蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑慧敏，钱近春，夏继波，
申请(专利权)人：苏州优逸兰迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：