一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法技术

本申请提供一种总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，以总甲状腺素抗原和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线上包被用，总甲状腺素抗体和羊抗鸡IgY混合作为荧光微球标记抗体，采用的荧光免疫层析法，与目前常见的检测总甲状腺素的方法如，酶联免疫法/化学发光法相比，不仅大大缩短了检测时间、降低检测成本，还提高了检测灵敏度，与同类方法比较，具有标记过程简单、灵敏度高、结果准确且稳定等优点。结果准确且稳定等优点。结果准确且稳定等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于体外诊断免疫层析检测领域，尤其是涉及一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法，具体地说是一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血清、血浆以及全血样本中总甲状腺素。

技术介绍

[0002]总甲状腺素(TT4)是由甲状腺分泌的一种激素，是血清中与蛋白结合的T4与游离T4的总量，TT4浓度升高出现甲亢，TT4浓度降低，出现甲减，为甲状腺功能体外试验的灵敏指标，可在一定程度上反映甲状腺功能状态，为临床诊断甲亢、甲减提供依据。
[0003]目前临床上用于测定TT4的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。过去以放免为代表的总甲状腺素(TT4)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的。
[0004]因此，亟需一种特异性高、灵敏度强的总甲状腺素试剂盒及其制备方法来解决上述问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决现有技术灵敏度不够、线性窄、特异性较差，无法精确的监测血液中的总甲状腺素含量的变化的技术问题，提供一种特异性高、灵敏度强、标记过程简单、结果准确且稳定的总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法。
[0007]为实现上述第一个目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂卡和稀释液，所述试剂卡包括PVC板以及依次设于所述PVC板上的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，所述结合垫中含有荧光微球标记的总甲状腺素标记抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；
[0009]所述检测线上包被有总甲状腺素抗原，包被浓度为0.8
‑
1.2mg/ml；
[0010]所述质控线上包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8
‑
1.2mg/ml。
[0011]优选的，荧光微球标记总甲状腺素标记抗体，步骤如下：
[0012]a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
[0013]b.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
[0014]c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min，弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；
[0015]d.加入总甲状腺素标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
[0016]e.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
[0017]f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；
[0018]g.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。
[0019]优选的，荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体，步骤如下：
[0020]a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
[0021]b.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；
[0022]c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min，弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；
[0023]d.加入羊抗鸡IgY抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
[0024]e.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；
[0025]f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；
[0026]g.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。
[0027]优选的，所述标记用的荧光微球为南京微测生物科技有限公司粒径为300nm的Eu
‑
荧光微球。
[0028]优选的，总甲状腺素标记抗体的标记量为10μg，羊抗鸡IgY标记抗体标记量为16μg。
[0029]优选的，标记抗体溶液喷量为3
‑
5μL/cm；
[0030]包被工作液喷量为0.8
‑
1.2μL/cm。
[0031]优选的，所述结合垫上荧光微球标记的总甲状腺素标记抗体中，荧光微球与总甲状腺素单标记抗体的投料比为20:1；
[0032]所述结合垫上荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体中，荧光微球与羊抗鸡IgY抗体的投料比为25:2。
[0033]优选的，所述稀释液的配方为：0.05％的Proclin 300；0.1M PBS缓冲液，pH7.4。
[0034]为了实现上述第二个目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0035]一种上述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，包括采用以下步骤制备试剂盒：
[0036]步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将总甲状腺素抗原、鸡IgY抗体分别按0.8
‑
1.2mg/mL浓度配制包被工作液，按0.8
‑
1.2mg/mL包被量，用金标划线机将其划到NC膜上的检测线和质控线后干燥；
[0037]步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液用喷金划线机按照3
‑
5μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上后干燥；
[0038]步骤3：样品垫经样品垫处理液处理好后干燥；
[0039]步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次贴在PVC板上，组装成试剂卡。
[0040]优选的，样品垫处理液配方，按100ml计算，由以下组分配制：抗人RBC抗体1mg、2mg阻断剂001、牛血清白蛋白1g、0.5mL Tween
‑
20、0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液100mL。
[0041]本试剂盒测定的原理：采用竞争法，利用荧光免疫层析的技术原理。测试时，样本与稀释液混匀，并滴加到试剂的加样孔中，样本中的TT4抗原与标记垫上荧光标记TT4单克隆抗体结合形成反应复合物。在毛细效应下进行层析，过量的荧光标记抗体沿着硝酸纤维素膜向前移动，与检测线包被的TT4抗原结合；样本中的TT4浓度与复合物荧光强度成反比，根据设定的标准曲线，干式荧光免疫检测仪将检测的荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂卡和稀释液，所述试剂卡包括PVC板以及依次设于所述PVC板上的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，其特征在于：所述结合垫中含有荧光微球标记的总甲状腺素标记抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体；所述检测线上包被有总甲状腺素抗原，包被浓度为0.8
‑
1.2mg/ml；所述质控线上包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8
‑
1.2mg/ml。2.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：荧光微球标记总甲状腺素标记抗体，步骤如下：a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；b.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min，弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；d.加入总甲状腺素标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；e.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；g.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。3.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于：荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体，步骤如下：a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；b.加入标记活化液20μL混匀，旋转混匀反应30min；c.进行离心30min，离心转速为10000rpm/min，弃去上清液，加入标记缓冲液200μL，超声；d.加入羊抗鸡IgY抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；e.加入标记封闭液20μL后超声，旋转混匀反应2h；f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液0.2mL超声；g.将标记物移入新的2mL离心管中，吸取标记保存液0.8mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入2mL离心管中，涡旋混匀。4.根据权利要求1所述的总甲状腺素荧光免疫层析法测定试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王胜岚，彭永林，李峰，
申请(专利权)人：派恩特中山生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：