一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株及其应用制造技术

本发明专利技术利用猪丁型冠状病毒PDCoV

【技术实现步骤摘要】
一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株及其应用

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[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株及其应用。

技术介绍
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[0002]PDCoV(猪丁型冠状病毒)属于套式病毒目、冠状病毒科、δ冠状病毒属，是近年来发现的一种新型猪肠道病病原。冠状病毒(Cornavirus，CoV)感染宿主的范围广泛，对自然界生物有极大的威胁性。CoV分为甲型、乙型、丙型、丁型四个属，而猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)属于丁型冠状病毒属，随着2012年PDCoV首次在猪粪便中检测到后，该病在全球不同地区陆续被发现，我国猪群PDCoV的感染也相当严重，部分地区猪群中腹泻病料样品中PDCoV阳性率超过25％。PDCoV可感染各种年龄段的猪群，但对新生仔猪的危害最大，感染率最高，引起的死亡率约为30
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40％。感染仔猪临床表现为水样腹泻、呕吐、脱水，剖检病理结果显示肠壁变薄，变透明，肠内充斥着大量黄色液体，组织病理学变化主要见于空肠中、远端和回肠，十二指肠和空肠近端的病变不明显，病变主要表现为肠绒毛上皮细胞萎缩、坏死，同时退化的肠上皮细胞进入管腔。
[0003]目前对于PDCoV，仍没有有效的治疗措施和疫苗。陕西诺威利华生物科技有限公司(本公司的母公司)是国内最早进入PDCoV疫苗研发的企业，且目前也有相关的疫苗在申报，公司基于分离得到的PDCoV
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SD株研发了猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗(ZL201711087386.4)以及猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗(ZL201711080927.0)等已经获得了国家知识产权局的专利授权，且相关疫苗的申报已经进入临床阶段。然而，我方发现，目前市场上PDCoV以灭活苗为主，而灭活苗始终存在需高剂量免疫的局限，相较之下，弱毒疫苗具有免疫原性好，能够激发宿主原位免疫的优势，弱毒苗不需佐剂且一次免疫即可产生较强免疫力。弱毒疫苗研究的关键是如何将病毒致弱同时使病毒保持较强的抗原性，因而，筛选合适的毒株对于弱毒疫苗的开发具有重要的意义。

技术实现思路
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[0004]为了丰富猪丁型冠状病毒疫苗的种类，以满足疫情防控的需要，本专利技术旨在提供一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株，该毒株由猪丁型冠状病毒AK株经传代致弱得到，所述毒株在ST细胞增殖时病毒含量稳定，另对仔猪的毒力显著降低，免疫原性稳定可靠，可作为弱毒疫苗研制候选毒株。
[0005]本专利技术具体采用如下技术方案：
[0006]一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV
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SD
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R株，其微生物保藏编号为CGMCC No.15897，分类命名:猪丁型冠状病毒，保藏时间是2018年06月25日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0007]所述猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV
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SD
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R株是由PDCoV
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SD clone10株经传代致弱而得到的。
[0008]优选地，所述PDCoV
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SD clone10株的微生物保藏编号为CGMCC No.16220。
[0009]本专利技术还请求保护猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV
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SD
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R株在制备预防猪丁型冠状病毒感染的药物中的应用。
[0010]优选的，所述药物为疫苗。
[0011]更优选地，所述疫苗为弱毒活疫苗；
[0012]更优选地，所述疫苗为单苗或联苗。
[0013]基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：
[0014]本专利技术利用猪丁型冠状病毒PDCoV
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SD clone10株在ST细胞上连续传代至F91代，期间先后共进行了5次病毒克隆纯化，筛选并培育出病毒含量高、特异性强、毒力显著降低但仍保持良好免疫原性的弱毒株。在毒株传代纯化过程中，先后将F15、F25、F56、F83、F88、F91代各克隆株接种健康仔猪，通过临床症状及剖检来综合判断病毒株的毒力是否降低，结果在F88代克隆株接种试猪后未表现出明显的腹泻症状，剖检后各脏器无明显变化，说明此时该毒株毒力已经弱化，为了确保病毒的稳定性，又对其进行了1次克隆纯化，F91代接种猪后仍表现出弱毒株的系列生物学特性，病毒含量也有所提高。为此，将PDCoV F88代、F91代2个克隆株接种仔猪，通过免疫后21日时的血清中和抗体效价和攻毒保护情况来评价免疫原性，结果F88代、F91代所有免疫猪的血清中和抗体效价均≥1∶79，对照组猪血清中和效价均≤1∶4。所有免疫组猪攻毒后均100％(10/10)保护，对照组猪在攻毒后全部出现腹泻症状，个别猪伴有呕吐、精神沉郁和脱水症状。至此，确定PDCoV
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SD
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R株经过在ST细胞上的连续传代和纯化至F91代时，其在ST细胞增殖时病毒含量稳定，另对仔猪的毒力显著降低，免疫原性稳定可靠，可作为弱毒疫苗研制候选毒株。
附图说明：
[0015]图1：猪丁型冠状病毒电镜观察。
[0016]图2：RT
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PCR扩增ST细胞培养物电泳图，M:DNA Marker 2000；1：第3代的ST细胞培养物；2：PDCoV阳性质粒样品；3：阴性对照。
[0017]图3：PDCoV AK株与流行毒株全基因序列绘制的基因进化树。
具体实施方式：
[0018]实施例1：猪丁型冠状病毒的分离与鉴定
[0019]1.组织病料：
[0020]2015年从陕西安康某养殖场采集有腹泻症状3～5日龄仔猪的回肠。
[0021]2.猪丁型冠状病毒分离：
[0022]将组织样品剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的单层ST细胞，吸附1小时后，弃去病毒液，PBS(0.01mol/L，pH值7.2)清洗三次后，加入细胞维持液，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，观察是否出现细胞病变，如此盲传至细胞出现病变，收获培养物并命名，置
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70℃以下保存。
[0023]病料接种ST细胞后，盲传2代，置37℃，含5％CO2的培养箱中培养72小时后，产生细胞病变，表现为变圆、细胞呈灶状脱落等。再继续传至第3代，收获培养物，标记为猪丁型冠状病毒AK株F3代，置
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70℃以下保存。
clone10株，其微生物保藏编号为CGMCC No.16220，分类命名:猪丁型冠状病毒，保藏时间是2018年08月22日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。实施例2：猪丁型冠状病毒弱毒毒株的制备
[0041]1.方法
[0042]1.1病毒的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV
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SD
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R株，其微生物保藏编号为CGMCC No.15897，分类命名: 猪丁型冠状病毒，保藏时间是2018年06月25日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2. 根据权利要求1所述的猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV
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SD
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R株，其特征在于，所述猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV
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SD
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R株是由PDCoV
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SD clone1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞，王昆，张磊，董剑辉，王璐，
申请(专利权)人：武汉华腾济康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：