一种病原镰刀菌病毒及其检测引物和检测方法技术

本发明专利技术涉及真菌病毒，具体涉及一种病原镰刀菌病毒及其检测引物和检测方法。本发明专利技术提供一种真菌病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V202295，名称为Fusarium fusarivirus1(FuFV1)。还提供用于检测所述真菌病毒的引物，其核苷酸序列如下：FuFV1

【技术实现步骤摘要】
一种病原镰刀菌病毒及其检测引物和检测方法


[0001]本专利技术涉及真菌病毒，具体涉及一种病原镰刀菌病毒及其检测引物和检测方法。

技术介绍

[0002]烟草是我国重要的经济作物之一。近年来，烟草镰刀菌侵染作物范围呈上升趋势，已经成为我国主要产烟区最严重的根茎病害之一，对烟叶生产造成严重的经济损失。烟草镰刀菌根腐病感病烟株地上部表现出长势较矮小，叶片发黄萎蔫自下而上；地下部根系组织不发达，主根或侧根有褐色坏死，湿度大时可致腐烂及白色霉层。
[0003]镰刀菌既可侵染植物又可在土壤内生存，属于土壤习居菌，种类繁多，分布很广，可侵染多种植物，包括粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物，引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等。镰刀菌产孢能力很强，孢子传播途径很多，除土传外还可以通过空气传播，侵染植物维管束系统，破坏植物的输导组织，是植物上发生最为广泛、最为严重的真菌病害之一。真菌病毒是指存在于真菌内并能够稳定复制的一类病毒，此类病毒主要分布在包括植物病原真菌在内的丝状真菌中，部分真菌病毒导致宿主植物病原真菌的致病力变化，研究并检测病原真菌携带的真菌病毒将为病原真菌致病力及致病机制的研究奠定基础。

技术实现思路

[0004]专利技术人在采用高通量测序技术对昆明烟草样品进行转录组测序时发现一个完整的真菌病毒信息，并进一步从感病烟草携带的病原镰刀菌中分离到该真菌病毒。该真菌病毒的完整基因组由6,391个核苷酸组成，包含两个ORFs，其中ORF1编码依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp；nt 66
‑/>4571)，ORF2编码假定蛋白(hypothetical protein；nt4450
‑
6072)。Blastp分析显示该真菌病毒与Alphafusarivirus属的Fusarium poae fusarivirus1具有最高的序列一致性，RdRp的氨基酸序列一致性为68.49％(覆盖率99％)，假定蛋白的氨基酸序列一致性为48.96％(覆盖率88％)。根据国际病毒分类委员会(ICTV)对Alphafusarivirus属种的划分标准，该真菌病毒属于Alphafusarivirus属的一种新病毒。因此，将该真菌病毒命名为Fusarium fusarivirus 1(FuFV1)。
[0005]基于上述研究，本专利技术提供一种真菌病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V202295，名称为Fusarium fusarivirus 1(FuFV1)。
[0006]为了研究上述真菌病毒(FuFV1)对病原真菌致病力及致病机制的影响，本专利技术提供用于检测所述真菌病毒(FuFV1)的引物，其核苷酸序列如下：
[0007]FuFV1
‑
F：5
’‑
CTCTTATGGCAGCGTTTCGC
‑3’
，
[0008]FuFV1
‑
R：5
’‑
TTTTGCCTTCGTGTCAAGCG
‑3’
。
[0009]本专利技术还提供用于检测所述真菌病毒(FuFV1)的试剂盒，其包括上述引物FuFV1
‑
F和FuFV1
‑
R。
[0010]上述试剂盒可以包括液态的或粉末状的引物FuFV1
‑
F和FuFV1
‑
R。
[0011]优选地，上述试剂盒还包括PCR常规试剂和/或试剂盒使用说明书。
[0012]所述PCR常规试剂可以是DNA聚合酶、dNTP混合物、PCR缓冲液、超纯水。
[0013]本专利技术进一步提供检测所述真菌病毒(FuFV1)的方法，其包括如下步骤：
[0014](1)提取待测样品的RNA并反转录获得cDNA；
[0015](2)以所述cDNA为模板，利用上述引物FuFV1
‑
F和FuFV1
‑
R进行PCR，得到扩增产物；
[0016](3)检测所述扩增产物，若出现841bp的目的片段，则所述待测样品中含有所述真菌病毒。
[0017]所述待测样品可以是疑似含有所述真菌病毒的植物器官、组织或真菌。
[0018]所述真菌可以是病原真菌，例如病原镰刀菌。
[0019]上述方法中，可以采用电泳或测序的方法检测所述扩增产物。所述电泳可以是琼脂糖凝胶电泳。
[0020]在本专利技术的一些实施例中，上述方法用于检测病原镰刀菌中是否含有病毒FuFV1，包括如下步骤：提取病原镰刀菌的总RNA并反转录获得cDNA；以cDNA为模板，利用上述引物FuFV1
‑
F和FuFV1
‑
R进行PCR，得到扩增产物；通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现841bp的条带，则判定所述病原镰刀菌中含有所述真菌病毒(FuFV1)。
[0021]在本专利技术的一些实施例中，提取病原镰刀菌RNA的具体步骤如下：
[0022](1)称取菌丝0.1g放入1.5mL离心管中，加入液氮，迅速将菌丝研磨成粉末，然后加入1mL TRNzol试剂，室温放置5min；
[0023](2)加入16μL 5M NaCl，200μL氯仿，涡旋振荡15s，室温放置3min；
[0024](3)于4℃，12000rpm离心15min，取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，室温放置5min；
[0025](4)于4℃，12000rpm离心10min，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置10min；
[0026](5)于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀；
[0027](6)于4℃，1000rpm离心5min，弃上清液，室温干燥后，加入50
‑
100μL RNase
‑
free ddH2O溶解RNA，得到RNA溶液。
[0028]在本专利技术的一些实施例中，将RNA反转录合成cDNA的方法如下：在20μL反应体系中加入4μL总RNA，4μL 5
×
PrimeScript IV cDNA Synthesis Mix，2μL FuFV1
‑
R，补RNase
‑
free ddH2O至20μL。在PCR仪中进行如下程序：30℃15min，42℃15min，70℃15min。
[0029]优选地，上述PCR的反应体系为Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.125μL，10
×
Taq缓冲液(20mM)1.5μL，dNTP混合物(各2.5mM)1.5μL，cDNA 2μL，FuFV1
‑
F(10μM)0.75μL，FuFV1
‑
R(10μM)0.75μL，补ddH2O至25μL。
[0030]优选地，上述PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种真菌病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V202295，名称为Fusarium fusarivirus 1(FuFV1)。2.用于检测权利要求1所述的真菌病毒的引物，其核苷酸序列如下：FuFV1
‑
F：5
’‑
CTCTTATGGCAGCGTTTCGC
‑3’
，FuFV1
‑
R：5
’‑
TTTTGCCTTCGTGTCAAGCG
‑3’
。3.用于检测权利要求1所述的真菌病毒的试剂盒，其包括权利要求2所述的引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR常规试剂和/或试剂盒使用说明书。5.检测权利要求1所述的真菌病毒的方法，其包括如下步骤：(1)提取待测样品的RNA并反转录获得cDNA；(2)以所述cDNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行PCR，得到扩增产物；(3)检测所述扩增产物，若出现84...

【专利技术属性】
技术研发人员：高福宏，王志江，杨东升，赵明富，陈兴全，吴国星，高熹，刘林，陈泽历，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：