一种重组人甲状腺球蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种重组人甲状腺球蛋白及其制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：S10：获取人甲状腺球蛋白基因序列的CDS序列；S20：优化并合成CDS序列，获得优化后的CDS序列；S30：构建重组表达载体；S40：目的蛋白的表达；S50：分离纯化目的蛋白。本发明专利技术解决了体外表达人甲状腺球蛋白的技术问题，在很大程度上降低人甲状腺球蛋白原料成本，以期实现降低TGAb检测价格的技术效果。测价格的技术效果。测价格的技术效果。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人甲状腺球蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种重组人甲状腺球蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]甲状腺球蛋白(TG)是一种潜在的自身抗原，当进入血液后可刺激机体产生抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)。TGAb是甲状腺疾病中首先发现的自身抗体，具有高度种属特异性，是诊断自身免疫甲状腺疾病的常用指标。在自身免疫性甲状腺炎患者中可发现TGAb浓度升高，出现频率是70％
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80％。Graves病TGAb的阳性率约为60％，经治疗后滴度下降提示治疗有效，如果滴度持续较高，易发展成黏液性水肿。甲状腺功能亢进症患者测得TGAb阳性且滴度较高，提示抗甲状腺药物治疗效果不佳，且停药后易复发。甲状腺癌与TGAb呈一定的相关性，阳性率可达13％
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65％，TGAb值的升高是肿瘤恶化的一种标志。
[0003]抗甲状腺球蛋白抗体的靶抗原甲状腺球蛋白是一种由甲状腺上皮细胞合成和分泌的可溶性碘化糖蛋白，分子量660KD，由2748个氨基酸组成。TGAb是TG进入血液后产生的抗体，通常存在于自身免疫性甲状腺疾病的病人体内。自身免疫性甲状腺疾病(AITD)是一种十分常见的甲状腺疾病，主要包括慢性/淋巴细胞性甲状腺炎(Hashimoto式病)、毒性弥漫性甲状腺肿(Graves病)，其共同特征是血液中存在多种甲状腺自身抗体，最主要的甲状腺自身抗体为抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)和抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO
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Ab)。患有Hashimoto病、Graves病、慢性甲状腺炎、亚急性甲状腺炎、甲状腺机能亢进等疾病的患者，血清TGAb水平升高。某些患有非自身免疫甲状腺疾病，如类风湿疾病、红斑狼疮、恶性贫血、I型糖尿病等疾病的病人，以及健康人特别是女人和老年人体中也可能检测到TGAb。
[0004]综上所述，现今TGAb检测不但是针对患有甲状腺疾病患者的检测，甚至已成为常规体检中重要的一项检测指标。市面上也有重组的人甲状腺球蛋白在售，但多为大肠杆菌表达的甲状腺球蛋白片段，如果将大肠杆菌表达的人甲状腺球蛋白制备成TGAb检测试剂，可预期其会造成临床样本漏检现象。国内外IVD生产的TGAb试剂中的人甲状腺球蛋白原料多为人甲状腺组织中提取，能够避免前者的临床样本漏检现象。但是，存在这样一个问题：人甲状腺组织来源受限，导致人甲状腺球蛋白原料成本高，这也是TGAb检测价格高的一个重要因素。

技术实现思路

[0005]本专利技术解决了体外表达人甲状腺球蛋白的技术问题，在很大程度上降低人甲状腺球蛋白原料成本，以期实现降低TGAb检测价格的技术效果。
[0006]为解决上述问题，本专利技术提供一种重组人甲状腺球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S10：获取人甲状腺球蛋白基因序列的CDS序列；
[0008]S20：优化并合成CDS序列，获得优化后的CDS序列；
[0009]S30：构建重组表达载体：将优化后的CDS序列利用Nhe I和Asc I双酶切后，插入Nhe I和Asc I双酶切的哺乳动物细胞表达载体中，获得重组表达载体；
[0010]S40：目的蛋白的表达：将重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中，以制备目的蛋白，离心收集细胞上清液；
[0011]S50：分离纯化目的蛋白：将细胞上清液浓缩后，进行镍柱亲和纯化，再用分子筛色谱柱分离出660KD
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700KD分子量区间的蛋白，获得重组人甲状腺球蛋白。
[0012]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：CDS为编码序列，对其进行优化后，再构建重组表达载体，通过转染哺乳动物细胞系制备重组人甲状腺球蛋白，蛋白制备简单，蛋白来源稳定，无需从人甲状腺组织中提取，且上述方法能够有效缩短蛋白制备周期，并有效降低人工成本和物料成本。
[0013]在本专利技术的一个实例中，合成CDS序列包括以下步骤：
[0014]S21：在CDS序列的上游依次添加Nhe I限制性酶切位点、kozak序列和ATG，在CDS序列的下游依次添加6
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His标签和Asc I限制性酶切位点，获得合成后的CDS序列。
[0015]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：kozak序列被广泛应用于表达载体的构建中，ATG为起始密码子，在CDS序列的上游和下游分别添加限制性酶切位点，以便插入同样酶切的表达载体，进而构建重组表达载体。并且，添加6个组氨酸编码序列，形成标签His
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tag，便于利用镍柱对制备的重组人甲状腺球蛋白进行分离纯化。
[0016]在本专利技术的一个实例中，优化CDS序列为针对哺乳动物细胞系进行密码子优化，优化后的CDS序列如SEQ ID NO：1所示。
[0017]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：针对哺乳动物细胞系进行密码子优化，密码子优化能够提高蛋白质的翻译效率，从而提高蛋白的表达量。
[0018]在本专利技术的一个实例中，哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤细胞、犬肾内皮细胞、小鼠脾细胞、人胚肾细胞、人体细胞杂交细胞中的任一种。
[0019]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：哺乳动物细胞系能够完成糖基化修饰和蛋白的正确折叠等复杂的翻译后修饰功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方便最接近天然的人甲状腺球蛋白。并且上述哺乳动物细胞系获取容易，能够被广泛应用于目的蛋白表达。
[0020]在本专利技术的一个实例中，转染为瞬时转染或稳定转染。
[0021]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：哺乳动物细胞表达系统是以哺乳动物细胞作为宿主进行蛋白表达生产，具有转录后修饰，蛋白正确折叠与装配等功能，表达的蛋白更接近天然状态，是活性蛋白因子及各类受体蛋白的优异表达系统。利用哺乳动物表达体系生产蛋白通常有两种方式：瞬时转染与稳定转染，这两者都是将目的基因转染至特定哺乳动物细胞内，进而表达得到目的蛋白。瞬时转染的优势有：能够快速生产得到微量至中量的重组蛋白；实验成本低；一个宿主可以带有多个拷贝，表达效率高。稳定转染的优势有：目的基因不会随着细胞传代而消失，进而能够长期稳定地生产目的蛋白。
[0022]在本专利技术的一个实例中，稳定转染制备目的蛋白包括以下步骤：
[0023]S61：将重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中；
[0024]S62：用抗性筛选试剂筛选出阳性克隆；
[0025]S63：对阳性克隆连续培养，离心收集培养的细胞上清液。
[0026]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：抗性筛选试剂能够用于筛选表达特定抗性基因的稳定细胞株，进而能够长期稳定生产目的蛋白，且得到稳转株之后后续生产蛋白的成本降低。
[0027]在本专利技术的一个实例中，瞬时转染制备目的蛋白包括以下步骤：
[0028]S71：将重组表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人甲状腺球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S10：获取人甲状腺球蛋白基因序列的CDS序列；S20：优化并合成所述CDS序列，获得优化后的所述CDS序列；S30：构建重组表达载体：将所述优化后的所述CDS序列利用Nhe I和Asc I双酶切后，插入Nhe I和Asc I双酶切的哺乳动物细胞表达载体中，获得所述重组表达载体；S40：目的蛋白的表达：将所述重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中，以制备所述目的蛋白；离心收集细胞上清液；S50：分离纯化所述目的蛋白：将所述细胞上清液浓缩后，进行镍柱亲和纯化，再用分子筛色谱柱分离出660KD
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700KD分子量区间的蛋白，获得所述重组人甲状腺球蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述合成所述CDS序列包括以下步骤：S21：在所述CDS序列的上游依次添加Nhe I限制性酶切位点、kozak序列和ATG，在所述CDS序列的下游依次添加6
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His标签和Asc I限制性酶切位点，获得合成后的所述CDS序列。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优化所述CDS序列为针对所述哺乳动物细胞系进行密码子优化，所述优化后的所述CDS序列如SEQ ID NO：1所示。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞系...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹继华，赵金华，许燕，杨克群，周海涛，宋丹丽，王芬，何进军，贾江花，
申请(专利权)人：美康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：