本发明专利技术公开了一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液和应用，所述肿瘤组织消化液由A类模块消化酶、B类模块消化酶、C类模块消化酶、D类模块消化酶中的一种或多种组合而成；使用A类模块消化酶、B类模块消化酶、C类模块消化酶、D类模块消化酶，根据不同来源或不同质地的肿瘤组织，可选择相应的模块消化酶进行消化，确保不同组织能被尽可能消化解离成细胞且不至于消化过度。于消化过度。于消化过度。
【技术实现步骤摘要】
一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液和应用
[0001]本专利技术涉及体外培养
，特别涉及一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液和应用。
技术介绍
[0002]肿瘤类器官培养是将从生物体获得的一部分肿瘤组织经过处理后，再将其与基质胶混合进行3D培养所得。与传统细胞系相比，肿瘤类器官与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，作为研究模型，也具有更高的相关性。因此，如何高效、低损伤且具有较大广谱性的将肿瘤细胞完好的从肿瘤组织中解离出来是类器官培养的重中之重。
[0003]目前使用较多的消化液多由胰酶和EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)，或者由单一胶原酶、金属盐、PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟)等配制而成。然而胰酶具有非特异消化蛋白特点且消化强度大，消化程度不易控制，在消化过程中容易发生细胞膜破损，甚至细胞裂解，导致细胞获得效率低甚至培养失败；而仅仅使用单一胶原酶，使得可消化组织类型也变得狭窄，且消化力度不够，导致细胞获得率减少，金属盐易水解且存在重金属盐易导致蛋白质变性情况，另外PMSF为有毒化合物，有较大的安全隐患。现有的消化酶溶液未添加缓冲物质和酶保护剂，使得整个消化酶体系的pH无法保持稳定，且消化酶本身易失活，这也容易造成实验失败。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液，以克服现有技术中的不足。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本申请公开了一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液，所述肿瘤组织消化液由A类模块消化酶、B类模块消化酶、C类模块消化酶、D类模块消化酶中的一种或多种组合而成；
[0007]所述A类模块消化酶由以下组分构成：Ⅱ型胶原酶50～200U/mL、透明质酸酶50～200U/mL、中性蛋白酶50～100U/mL，脱氧核糖核酸酶Ⅰ25～50U/mL、4
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(2
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氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.1～1mM、马黛茶多糖乙酰氧基甲酯2～6mg/mL，黄芪甲苷20～50μg/mL、4
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羟乙基哌嗪乙磺酸10～25mM、D
‑
葡萄糖10～20mM、氯化钠90～110mM、氯化钾4～8mM、L
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丙氨酰
‑
L
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谷氨酰胺1～2mM，甘氨酸0.1～0.3mM，pH缓冲对5～25mM，金属络合物0.1～15mM、灭菌超纯水和二甲亚砜溶剂；
[0008]所述B类模块消化酶由以下组分构成：Ⅳ型胶原酶100～400U/mL、半胱氨酸0.05～0.2mM、灭菌超纯水溶剂；
[0009]所述C类模块消化酶由以下组分构成：
Ⅴ
型胶原酶100～400U/mL、半胱氨酸0.05～0.2mM、灭菌超纯水溶剂；
[0010]所述D类模块消化酶由以下组分构成：弹性蛋白酶50～200U/mL、脱氧核糖核酸酶Ⅰ25～50U/mL、半胱氨酸0.05～0.2mM、灭菌超纯水溶剂；
[0011]作为优选，所述pH缓冲对由10～20mM的碳酸氢钠和5～10mM的磷酸二氢钠构成；或所述pH缓冲对由10～20mM的磷酸氢二钠和10～20mM的磷酸二氢钠构成。
[0012]作为优选，所述金属络合物由0.5～5mM的枸橼酸钙和1～10mM的枸橼酸锰构成；或所述金属络合物由0.5～5mM的甘氨酸钙和0.5～5mM的枸橼酸镁构成；或所述金属络合物由0.5～5mM的枸橼酸钙、0.5～5mM的枸橼酸镁和0.5～2mM的甘氨酸锌构成。
[0013]作为优选，所述A类模块消化酶的pH在7.0
‑
7.4。
[0014]作为优选，所述A类模块消化酶的制备方式如下：
[0015]S1、将Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、4
‑
(2
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氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、D
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葡萄糖、氯化钠、氯化钾、L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺、甘氨酸、pH缓冲对、金属络合物溶解于灭菌超纯水中；
[0016]S2、将马黛茶多糖乙酰氧基甲酯和黄芪甲苷溶于二甲亚砜；
[0017]S3、将步骤S1得到的溶液和步骤S2得到溶液混合均匀，调节pH至7.0
‑
7.4，过滤得到A类模块消化酶；
[0018]所述B类模块消化酶的制备方式如下：将Ⅳ型胶原酶，半胱氨酸溶解于灭菌超纯水中，过滤得到B类模块消化酶；
[0019]所述C类模块消化酶的制备方式如下：将
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型胶原酶，半胱氨酸溶解于灭菌超纯水中，过滤得到C类模块消化酶；
[0020]所述D类模块消化酶的制备方式如下：将弹性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、半胱氨酸溶解于灭菌超纯水中，过滤得到D类模块消化酶。
[0021]本专利技术还公开了一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液的应用，所述肿瘤组织消化液应用于肿瘤组织的消化，所述肿瘤组织包括间质细胞含量高于肿瘤细胞含量的肿瘤组织、间质细胞含量等于肿瘤细胞含量的肿瘤组织、间质细胞含量低于肿瘤细胞含量的肿瘤组织、离心后半透明胶质体积大于等于细胞沉淀体积2倍的肿瘤组织；
[0022]对于肿瘤组织包括间质细胞含量高于肿瘤细胞含量的肿瘤组织，采用仅由A类消化酶构成的肿瘤组织消化液消化；
[0023]对于间质细胞含量等于肿瘤细胞含量的肿瘤组织，采用由A类消化酶和B类消化酶构成的肿瘤组织消化液消化；
[0024]对于间质细胞含量低于肿瘤细胞含量的肿瘤组织，采用由A类消化酶和C类消化酶构成的肿瘤组织消化液消化；
[0025]对于离心后半透明胶质体积大于等于细胞沉淀体积2倍的肿瘤组织，其胶质采用仅由D类消化酶构成的肿瘤组织消化液消化。
[0026]本专利技术的有益效果：
[0027]1、本专利技术使用A类模块消化酶、B类模块消化酶、C类模块消化酶、D类模块消化酶，根据不同来源或不同质地的肿瘤组织，可选择相应的模块消化酶进行消化，确保不同组织能被尽可能消化解离成细胞且不至于消化过度；
[0028]2、使用4
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(2
‑
氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐替代PMSF，既能抑制丝氨酸酶功能性损伤，又能停止使用有毒试剂。
[0029]3、使用金属络合物，既能催化酶促反应，又能降低重金属离子对细胞的伤害。
[0030]4、添加的pH缓冲对和氨基酸类物质，可以保证消化酶溶液的稳定性。
[0031]5、使用马黛茶多糖乙酰氧基甲酯和黄芪甲苷可以维持细胞活性、抑制凋亡，同时具有广谱抗菌、抗氧化作用，并且对细胞无毒害作用。
[0032]本专利技术的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
附图说明
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液，其特征在于：所述肿瘤组织消化液由A类模块消化酶、B类模块消化酶、C类模块消化酶、D类模块消化酶中的一种或多种组合而成；所述A类模块消化酶由以下组分构成：Ⅱ型胶原酶50~200U/mL、透明质酸酶50~200U/mL、中性蛋白酶50~100U/mL，脱氧核糖核酸酶Ⅰ25~50U/mL、4
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氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.1~1mM、马黛茶多糖乙酰氧基甲酯2~6mg/mL，黄芪甲苷20~50μg/mL、4
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羟乙基哌嗪乙磺酸10~25mM、D
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葡萄糖10~20mM、氯化钠90~110mM、氯化钾4~8mM、L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺1~2mM，甘氨酸0.1~0.3mM，pH缓冲对5~25mM，金属络合物0.1~15mM、灭菌超纯水和二甲亚砜溶剂；所述B类模块消化酶由以下组分构成：Ⅳ型胶原酶100~400U/mL、半胱氨酸0.05~0.2mM、灭菌超纯水溶剂；所述C类模块消化酶由以下组分构成：
Ⅴ
型胶原酶100~400U/mL、半胱氨酸0.05~0.2mM、灭菌超纯水溶剂；所述D类模块消化酶由以下组分构成：弹性蛋白酶50~200U/mL、脱氧核糖核酸酶Ⅰ25~50U/mL、半胱氨酸0.05~0.2mM、灭菌超纯水溶剂。2.如权利要求1所述的一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液，其特征在于：所述pH缓冲对由10~20mM的碳酸氢钠和 5~10mM的磷酸二氢钠构成；或所述pH缓冲对由10~20mM的磷酸氢二钠和10~20mM的磷酸二氢钠构成。3.如权利要求1所述的一种高效低损伤组合式肿瘤组织消化液，其特征在于：所述金属络合物由0.5~5mM的枸橼酸钙和1~10mM的枸橼酸锰构成；或所述金属络合物由0.5~5mM的甘氨酸钙和0.5~5mM的枸橼酸镁构成；或所述金属络合物由0.5~5mM的枸橼酸钙、0.5~5mM的枸橼酸镁和0.5~2mM的甘氨酸锌构成。4.如权利要求1所述的一种高效低损伤组合式肿瘤组...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖红江，王丰，解翠薇，张超然，
申请(专利权)人：杭州济扶科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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