本发明专利技术公开了一种高复苏率、高兼容性的冻存液及其制备方法和应用，包括如下步骤：取动物血清白蛋白溶解于培养液得到动物血清白蛋白母液；取漏芦糖溶解于培养液得到漏芦糖母液；取罗望子多糖溶解于培养液得到罗望子多糖母液；取昆虫抗冻蛋白溶解于培养液得到昆虫抗冻蛋白母液；取穿心莲内酯溶解于二甲基亚砜得到穿心莲内酯母液；取动物血清白蛋白母液、漏芦糖母液、罗望子多糖母液和培养液混合得到混合液，根据混合液的体积，按照比例取昆虫抗冻蛋白母液、穿心莲内酯母液混合均匀后，过滤得到冻存液。使用天然无毒、高生物相容性CPA替代高毒性CPA，忽略CPA对样本的毒性，冻存样本复苏活率高；使用成分明确的BSA和CfAFP代替成分复杂的血清，体系更加稳定。体系更加稳定。体系更加稳定。
【技术实现步骤摘要】
一种高复苏率、高兼容性的冻存液及其制备方法和应用
[0001]本专利技术涉及冷冻保存
，特别涉及一种高复苏率、高兼容性的冻存液及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]细胞的新陈代谢随着温度下降会变弱，而当环境温度低于
‑
70℃时，细胞几乎停止代谢，呈现出类似“休眠”的状态。根据此现象，在使用血清、培养液、CPA(cryoprotective agent，冷冻保护剂)等试剂后，对细胞进行超低温冷冻保存，有利于该品系的保种，而超低温冷冻保存技术也是现阶段最有效的细胞长期保存技术。
[0003]CPA是一类混合在冻存液中可以降低冻存伤害细胞的化合物，一般分为渗透型和非渗透型两种类型。其中渗透型CPA主要有DMSO、乙二醇、丙二醇等，通过其溶剂效应降低细胞内电解质的浓度，降低微小冰晶；非渗透型CPA则主要有聚乙烯吡咯酮(PVP)、聚乙二醇、葡聚糖、海藻糖等，通过增加细胞外渗透压，减少细胞内水分含量，降低了微小冰晶。
[0004]目前，细胞冻存主要有两种方法，分别为慢速冻存法和玻璃化法；其中慢速冻存法降温缓慢，冷冻保护剂浓度较低，化学毒害较轻，但只能缓慢降温，故形成较多小冰晶导致的机械损伤较大；而玻璃化法由于添加了高浓度冷冻保护剂，可以直接将其置于超低温环境，快速结冻，从而减少形成小冰晶，机械损伤较小，但化学毒害较重。
[0005]因此，尽管目前超低温冷冻保存技术较为成熟，但主要保存对象是性质较为稳定的细胞系、胚胎组织、微生物等。对于较为脆弱的原代细胞、类器官以及新鲜肿瘤组织，目前成熟的冻存技术仍然较为稀缺。
[0006]抗冻蛋白(antifreeze proteins，AFPs)是一类可以帮助生物在低温环境下维持存活的特异性蛋白质，微生物、昆虫、鱼类、植物等多种生物体内均存在天然AFPs。由于AFPs有热滞现象、抑制胞体重结冰、修饰冰晶形态及保护细胞膜等抗低温伤害特性，近年来天然提取和生物工程制备的AFPs已被广泛应用于器官移植、低温医学和生殖医学等领域。
[0007]TSP是一种半乳糖木葡聚糖，作为一种天然大分子冷冻保护剂，具有无毒，高生物相容性、冰重结晶抑制活性的作用。
[0008]细胞在冻存、复苏过程极易形成损伤，包括可能发生的胞内、胞外小冰晶形成和升温时重结冰产生的机械损伤，冷冻保护剂的毒性，渗透压休克等情况，导致细胞结构和功能损伤，甚至活力丧失。因此，减少细胞冷冻损伤的相关研究一直备受重视，而其中CPA的选择就尤为重要，目前，细胞冻存多以DMSO为主，其毒性较大，对于类器官及组织冻存效果均不佳。
[0009]同时，传统冻存液中含有动物血清，因其成分较为复杂，来源受限，对于性质不太稳定的原代细胞和类器官的影响较大，且价格昂贵，故不推荐使用。
技术实现思路
[0010]本专利技术的目的在于提供一种高复苏率、高兼容性的冻存液及其制备方法和应用，
以克服现有技术中的不足。
[0011]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0012]本申请公开了一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制备方法，具体包括如下步骤：
[0013]S1、取动物血清白蛋白，溶解于Advance DMEM/F12培养液中，得到动物血清白蛋白母液；
[0014]S2、取漏芦糖，溶解于Advance DMEM/F12培养液中，得到漏芦糖母液；
[0015]S3、取罗望子多糖，溶解于Advance DMEM/F12培养液中，得到罗望子多糖母液；
[0016]S4、取昆虫抗冻蛋白，溶解于Advance DMEM/F12培养液中，得到昆虫抗冻蛋白母液；
[0017]S5、取穿心莲内酯溶解于二甲基亚砜中，得到穿心莲内酯母液；
[0018]S6、先取动物血清白蛋白母液、漏芦糖母液、罗望子多糖母液和Advance DMEM/F12培养液混合得到混合液，根据混合液的体积，按照比例取昆虫抗冻蛋白母液、穿心莲内酯母液混合均匀后，过滤得到高复苏率、高兼容性的冻存液。
[0019]作为优选，步骤S1中取动物血清白蛋白，溶解于Advance DMEM/F12培养液中，得到0.16～0.625g/mL的动物血清白蛋白母液。
[0020]作为优选，步骤S2中取漏芦糖，溶解于Advance DMEM/F12培养液中，得到0.15～0.5g/mL的漏芦糖母液。
[0021]作为优选，步骤S3中取罗望子多糖，溶解于Advance DMEM/F12培养液中，得到0.16～0.625g/mL的罗望子多糖母液。
[0022]作为优选，步骤S4中取昆虫抗冻蛋白，溶解于Advance DMEM/F12培养液中，得到1～5mg/mL的昆虫抗冻蛋白母液。
[0023]作为优选，步骤S5中，取穿心莲内酯溶解于二甲基亚砜中，获得10～50mg/mL穿心莲内酯母液。
[0024]作为优选，步骤S6中，取5～15份动物血清白蛋白母液、5～15份漏芦糖母液、5～15份罗望子多糖母液和55～85份Advance DMEM/F12培养液混合得到混合液；再添加混合液体积的1/10000～1/100的昆虫抗冻蛋白母液和1/10000～1/5000的穿心莲内酯母液；混合均匀后，使用滤膜过滤可得所述高复苏率、高兼容性的冻存液。
[0025]一种高复苏率、高兼容性的冻存液，具体包括以下组分：混合液1份、1/10000～1/100份的昆虫抗冻蛋白母液、1/10000～1/5000份的穿心莲内酯母液；所述混合液由5％～15％动物血清白蛋白母液、5％～15％漏芦糖母液、5％～15％罗望子多糖母液、55％～85％Advance DMEM/F12培养液组成。
[0026]一种高复苏率、高兼容性的冻存液的应用，所述冻存液应用于肿瘤组织或原代细胞、类器官；
[0027]所述冻存液应用于肿瘤组织的方式如下：将肿瘤组织裁剪成若干个组织块，按照比例与所述冻存液混合，在环境温度2～8℃的条件下静置0.5～1小时，再转换至环境温度
‑
70～
‑
80℃的条件下24～36小时，最后转入液氮保存；
[0028]所述冻存液应用于原代细胞、类器官的方式如下：将原代细胞或类器官直接按照比例与所述冻存液混合，在环境温度
‑
70～
‑
80℃的条件下静置24～36小时；再转入液氮保存。
[0029]作为优选，所述组织块的大小为1
‑
5mm3；所述组织块与冻存液的比例为100
‑
200个/mL。
[0030]作为优选，所述原代细胞或类器官与冻存液的比例为1
×
104～1
×
106/mL。
[0031]本专利技术的有益效果：
[0032]1、操作简便，冻存范围广，可覆盖原代细胞、类器官乃至肿瘤组织冻存。
[0033]2、由于所选CPA无毒且高生物相容性，冻存样本复苏活率高。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1、取动物血清白蛋白，溶解于AdvanceDMEM/F12培养液中，得到动物血清白蛋白母液；S2、取漏芦糖，溶解于AdvanceDMEM/F12培养液中，得到漏芦糖母液；S3、取罗望子多糖，溶解于AdvanceDMEM/F12培养液中，得到罗望子多糖母液；S4、取昆虫抗冻蛋白，溶解于AdvanceDMEM/F12培养液中，得到昆虫抗冻蛋白母液；S5、取穿心莲内酯溶解于二甲基亚砜中，得到穿心莲内酯母液；S6、先取动物血清白蛋白母液、漏芦糖母液、罗望子多糖母液和Advance DMEM/F12培养液混合得到混合液，根据混合液的体积，按照比例取昆虫抗冻蛋白母液、穿心莲内酯母液混合均匀后，过滤得到高复苏率、高兼容性的冻存液。2.如权利要求1所述的一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制备方法，其特征在于：步骤S1中取动物血清白蛋白，溶解于AdvanceDMEM/F12培养液中，得到0.16～0.625g/mL的动物血清白蛋白母液。3.如权利要求1所述的一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制备方法，其特征在于：步骤S2中取漏芦糖，溶解于AdvanceDMEM/F12培养液中，得到0.15～0.5g/mL的漏芦糖母液。4.如权利要求1所述的一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制备方法，其特征在于：步骤S3中取罗望子多糖，溶解于AdvanceDMEM/F12培养液中，得到0.16～0.625g/mL的罗望子多糖母液。5.如权利要求1所述的一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制备方法，其特征在于：步骤S4中取昆虫抗冻蛋白，溶解于AdvanceDMEM/F12培养液中，得到1～5mg/mL的昆虫抗冻蛋白母液。6.如权利要求1所述的一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制备方法，其特征在于：步骤S5中，取穿心莲内酯溶解于二甲基亚砜中，获得10～50mg/mL穿心莲内酯母液。7.如权利要求1所述的一种高复苏率、高兼容性的冻存液的制...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖红江，王丰，解翠薇，张超然，
申请(专利权)人：杭州济扶科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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