具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用技术

本发明专利技术的目的是提供具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术所述多肽的制备方法，包括如下步骤：（1）制备直链多肽，所述直链多肽的序列如SEQ ID NO:1；（2）所述直链多肽中两个半胱氨酸残基的巯基与N,N

【技术实现步骤摘要】
具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一种广泛存在于自然界的小分子多肽，具有独特的抗菌机制，包括裂解病原菌生物膜、与胞内靶点结合诱导死亡等。因抗菌谱广、不易产生耐药性的特点，抗菌肽被认为是潜在的抗生素替代品，有望运用于畜牧生产、医疗卫生等领域。BMAP
‑
27是一种众所周知的肽，来源于牛，具有由阳离子NH2形成的两亲性α螺旋末端。它已被证明对细菌、真菌、病毒和寄生虫均具有强大的杀伤活性。但BMAP
‑
27具有一定的细胞毒性，因此无法作为药物应用。BMAP
‑
18由牛源性天然抗菌肽BMAP
‑
27改造而来，保留具有α螺旋结构的N端序列的同时去除C端疏水尾巴以降低细胞毒性，可用于治疗皮肤粘膜的细菌感染
[0003][0004]由于乙胺丁醇和异烟肼、利福平等治疗结核病的常用药治疗周期长，且对产生耐药性的病原菌无治疗效果，因此结核病至今仍对人类安全及畜牧业发展产生着巨大的威胁与损害。
[0005]结核病病原包括结核分枝杆菌等。现有技术中缺乏副作用小且效果好的抗结核分枝杆菌的药物。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种对细胞毒性小且高效抗结核分支杆菌的多肽。
[0007]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0008]具有抗结核分枝杆菌活性的多肽，结构式如下：
[0009][0010]本专利技术还提供所述多肽的制备方法，包括如下步骤：
[0011](1)制备直链多肽，所述直链多肽的序列如SEQ ID NO:1；
[0012](2)所述直链多肽中两个半胱氨酸残基的巯基与N,N
’‑
双(2
‑
羟乙基)对苯二甲酰胺进行脱水缩合反应，得到所述多肽。
[0013]在本专利技术中，直链多肽与N,N
’‑
双(2
‑
羟乙基)对苯二甲酰胺的摩尔比为1：7
‑
15。
[0014]在本专利技术中，步骤(2)中所述直链多肽和N,N
’‑
双(2
‑
羟乙基)对苯二甲酰胺分别溶于相应溶剂中，然后再混合，进行脱水缩合反应。
[0015]在本专利技术中，直链多肽的溶剂为三氟乙酸和盐酸胍的混合溶液、尿素水溶液、乙腈、PBS缓冲液中的一种；N,N
’‑
双(2
‑
羟乙基)对苯二甲酰胺的溶剂为水、乙腈、甲醇和DMF中的一种。
[0016]在本专利技术中，所述尿素水溶液的浓度为4
‑
8mol/L。
[0017]在本专利技术中，所述直链多肽在溶剂中的浓度1mmol/L
‑
8mmol/L，N,N
’‑
双(2
‑
羟乙基)对苯二甲酰胺在溶剂中的浓度为15mmol/L
‑
80mmol/L。
[0018]在本专利技术中，步骤(2)反应中加入酸反应调节剂；所述酸反应调节剂为三氟乙酸；直链多肽溶液与酸反应调节剂之间的体积比为1:1～1:3。
[0019]在本专利技术中，步骤(2)中反应温度为0
‑
40℃，反应时间为0
‑
10min。
[0020]本专利技术还提供所述多肽在制备抗结核分枝杆菌的药物中的应用。
[0021]与多肽BMAP
‑
18相比，多肽SAH4的有益效果如下：SAH4对小鼠巨噬细胞的细胞毒性较BMAP
‑
18有明显下降，SAH4的细胞毒性IC50值是400μM，BMAP
‑
18是150μM，因此安全性显著提高，副作用减少；在最小抑菌试验中，SAH4在25μM的浓度下具有很强的抗BCG细菌感染作用，而相同条件下，BMAP
‑
18的最小抑菌浓度为300μM，抑菌能力仅为SAH4的十二分之一；在BMAP
‑
18中加入浓度为5μg/mL的胰蛋白酶，30min后多肽全部被水解，而SAH4在同样环境中，30min后仍有66.68％未被水解，1h后还可剩下43.82％的部分。多肽SAH4，是一种抗菌肽，在后抗生素时代以其独特的作用方式可以在规避耐药性副作用的同时达到治疗疾病的作用，因此具有非常广泛的应用前景，极具研究价值。
附图说明
[0022]图1制备多肽SAH4的反应原理。
[0023]图2是粗品直链多肽GRFKRFC7KKFC
11
KLFKKLS
‑
OH的色谱图。
[0024]图3是多肽GRFKRFC7KKFC
11
KLFKKLS
‑
OH的质谱图。
[0025]图4是N,N
’‑
双(2
‑
羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽的制备色谱图。
[0026]图5是N,N
’‑
双(2
‑
羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽的质谱图。
[0027]图6显示了各浓度SAH4及BMAP
‑
18作用于RAW264.7细胞的细胞存活率，横坐标为浓度，单位是μM，纵坐标是细胞存活率，单位是％。
[0028]图7是SAH4及BMAP
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18在RAW264.7细胞上IC50值的拟合结果。
[0029]图8是RP
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HPLC检测BMAP
‑
18在胰蛋白酶(5μg/mL)环境中不同时间的多肽剩余情况的色谱图，图A的反应时间为0min，图B的反应时间为15min，图C的反应时间为30min。
[0030]图9是RP
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HPLC检测SAH4在胰蛋白酶(5μg/mL)作用下不同时间的多肽剩余情况的色谱图，图A的反应时间为0min，图B的反应时间为15min，图C的反应时间为30min，图D的反应时间为60min。
具体实施方式
[0031]本申请中的BCG细菌是减毒牛型结核分枝杆菌，ATCC编号是bio
‑
77983，购自中国兽医药品监察所。
[0032]下面结合附图详细说明本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。
[0033]实施例1多肽SAH4的筛选及制备
[0034]1.多肽SAH4的筛选
[0035]BMAP
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18序列(由N端到C端)为：G
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R
‑
F
‑
K
‑
R
‑
F
‑
R
‑
K
‑
K
‑
F
‑
K
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有抗结核分枝杆菌活性的多肽，结构式如下：2.权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备直链多肽，所述直链多肽的序列如SEQ ID NO:1；(2)所述直链多肽中两个半胱氨酸残基的巯基与N,N
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双(2
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羟乙基)对苯二甲酰胺进行脱水缩合反应，得到所述多肽。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于直链多肽与N,N
’‑
双(2
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羟乙基)对苯二甲酰胺的摩尔比为1：7
‑
15。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述直链多肽和N,N
’‑
双(2
‑
羟乙基)对苯二甲酰胺分别溶于相应溶剂中，然后再混合，进行脱水缩合反应。5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于直链多肽的溶剂为三氟乙酸和盐酸胍的混合溶液、尿素水溶液、乙腈、PBS缓冲液中的一种；N,N
’‑

【专利技术属性】
技术研发人员：薛峰，罗浩东，黄群涛，孙浩，宋晶林，李云锋，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：