一种脂质体中磷脂含量的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种脂质体中磷脂含量的测定方法，它包括以下步骤：制备Ａ显色剂、Ｂ显色剂；配制标准储备液；配制样品溶液；绘制标准曲线；进行样品的含量测定：精密吸取制备的脂质体样品溶液０．５ｍｌ于１５×２００ｍｍ试管中，依次加入０．４ｍｌ浓度为１０Ｎ硫酸和３０％过氧化氢溶液０．１ｍｌ；温度１７０℃恒温加热６０分钟；冷却后，在每个试管中加入９ｍｌ蒸馏水，混匀吸取１．５ｍｌ于另一试管，再分别加４．６ｍｌ显色Ａ和０．１ｍｌ显色Ｂ溶液，于１００℃水浴加热１５分钟；冷却后在波长在８２２ｎｍ处比色测定吸收度；将所得样品吸收度数值代入回归曲线方程，求出样品中磷的含量。本发明专利技术方法简便、易操作，大大提高了测定结果的准确度，也提高了测定结果精密度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种药物载体的质量控制方法，具体地说是脂质体中磷脂含量的测定方法。
技术介绍
脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊。由于其具有缓释、低毒 及组织靶向性等特点，目前已应用于包载药物、基因转移等许多方面。磷脂是脂质体的 重要组分之一。其易发生水解和氧化，水解会导致脂质体中包封药物的渗漏，而氧化产 生的氧化反应对人体有一定得毒性。因此测定磷脂含量是衡量脂质体稳定性一项重要指 标。目前测定磷脂含量的方法，主要有高效液相色普法、钼蓝比色法、钒钼酸盐紫外分 光光度法、荧光法、硫氰铁铵显色法。但现有文献所公开的内容一般均是从检测原理上 进行总的论述与探讨。故其所述方法专属性差，精确度低。而在实际应用中，通常对特 定磷脂的检测需要有特定的检测方法。CN 1358997提供了一种针对血清高密度脂蛋白磷 脂及低密度脂蛋白磷脂的测定方法；研究者白研提供了一种对广东德庆何首乌中卵磷脂 含量进行测定的方法(广东药学(2004)第14巻第5期第3页)。李宝齐提供了一种测定 脂质体凝胶剂中磷脂含量的方法(中国药剂学杂志(2005)第3巻第5期)，该方法是将样 品用硝酸、高氯酸消化，调pH值后，加入钼蓝法显色剂，在830nm测定吸收度，经计算 得脂质体凝胶剂中磷脂的含量。该方法虽然是针对脂质体中磷脂特别设计的检测方法， 但其显色试剂溶液配比不合理，显色结果差；且所用试剂种类多、操作步骤复杂。在检 测过程中还需电炉加热，温度不易控制，同时易产生爆沸现象。
技术实现思路
本专利技术的目的就是要提供一种准确性高，且安全、简便、易操作的针对脂质体中磷脂进行含量测定的新方法。 本专利技术目的是这样实现的 本专利技术所提供的脂质体中磷脂含量的测定方法，包括以下步骤 a、显色剂的制备 A显色剂精密称取0.22克钼酸铵，用蒸馏水溶解后倒入100毫升的容量瓶中， 然后缓慢加入4.72毫升分析纯硫酸，放凉后稀释定容至刻度，并且倒入棕色瓶中冷藏； B显色剂精密称取15.00克L-抗坏血酸于烧杯中，用14% Na2S03溶解并定容 至100毫升容量瓶中，倒入棕色瓶中冷藏； b、磷标准储备液的配制精确称取干燥的分析纯磷酸二氢钾0.4394克溶解转移 至1000毫升容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀既得100ug.mL—1浓度。 c、样品溶液配制精确吸取1.0ml被测样品脂质体溶液于10毫升容量瓶中，加 水稀释至刻度；d、标准曲线绘制精密吸取标准储备液O.l、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l.Oml分别置于试管中，得到质量浓度分别为10、 20、 40、 60、 80、 100ug.mL—1的标样，分别加入0.4 毫升ION的H2S04和0.1毫升30% H202消化，消化时将该试管放置到预先升温17(TC并 且恒定的多孔恒温控制箱消化60分钟；然后取出试管，冷却后在每个试管中加入9ml蒸 馏水，混匀后逐个吸取1.5ml于另一试管，再分别加4.6ml A显色剂和0.1ml B显色剂溶 液，于IO(TC水浴加热15分钟；冷却后在波长822-830nm处比色测定吸收值，以质量浓 度ug.mi;工为横坐标，吸收值A为纵坐标，绘制标准曲线； e、样品的含量测定精密吸取制备的样品溶液0.5ml于15X 200mm试管中，依 次加入0.4ml浓度为ION硫酸和30 %过氧化氢溶液0.1ml消化；消化时将该试管放置到预 先升温恒定的多孔恒温控制箱中，设定温度17(TC，加热时间60分钟；然后取出试管。 冷却后在每个试管中加入9ml蒸馏水，混旋后逐个吸取1.5ml于另一试管，再分别加4.6ml A显色剂和0.1ml B显色剂溶液，于10(TC水浴加热15分钟；冷却后在波长在822-830nm 处比色测定样品的吸收度。将所得样品吸收度数值代入回归曲线方程，求出样品中磷的 本专利技术方法检测所依据的原理是在一定温度下的酸性溶液中，磷酸根可与钼 酸根(Mo04)2—络合，在还原剂作用下生成蓝色络合物(2Mo(V4McA;^H3P04，蓝色强度 与溶液中的磷酸根呈正比，用分光光度法在最大吸收波长处测定其吸收值，根据标准曲 线计算磷含量。 本专利技术的创新之处在于，采用的显色剂其显色反应颜色稳定、显示效果好；所 用试剂种类少、方法简便、易操作，大大提高了测定结果的准确度，也提高了测定结果 的精密度；在消化时将试管放置到预先升温17(TC并且恒定的多孔恒温控制箱内进行， 由此可有效控制溶液的反应温度，克服了现有方法中易发生的爆沸、蒸干等现象，同时 提高了实验操作的安全性，减少环境污染。本专利技术将测定波长选择在822nm，进一步提高了该方法检测的精确度。 附图说明 图1是文献方法实验结果图 图2是本专利技术方法试验结果图 本专利技术的有益效果通过以下实验得到了证明 精密度试验 试验方法 精密吸取三个不同体积的磷标准储备液分别置于试管中，得到到一定的质量浓 度的标样，依次加入0.4ml浓度为10N硫酸和30X过氧化氢溶液0.1ml ;将该试管放置到 预先升温17(TC并且恒定的多孔恒温控制箱消化60分钟；然后取出试管，冷却后在每个 试管中加入9ml蒸馏水，混旋后逐个吸取1.5ml于另一试管，再分别加4.6ml A显色剂和 0.1ml B显色剂溶液，于IO(TC水浴加热15分钟；冷却后在波长822nm处比色测定吸收 值，同时制备5个平行样品， 一个空白对照品，于822nm处同法测定，计算该精密度试 验方法的RSD值为1.08。4 具体实验数据见表1 表1精密度实验结果<table>table see original document page 5</column></row><table> 回收率试验 取三组试验，分别配制低、中、高三种浓度磷标准储备液，操作条件与精密度试验方法相同，于822nm处测定吸收度；如法重复3次取平均值。 具体实验数据见表2 表2回收率实验结果<table>table see original document page 5</column></row><table> 三组试验回收率为95.1 103.2% 稳定性试验 试验操作条件与精密度试验方法相同，经过在100分钟内多次测定吸收值，结 果基本无变化，说明该方法在加入显色剂反应生成的络合物稳定性良好。具体实验数据 见表3 表3稳定性实验结果<table>table see original document page 5</column></row><table> 对比试验(本专利技术方法与现有技术对比试验)现有技术(按照《广东药学》广东德庆何首乌中卵磷值含量测定)重复性测定吸 光度值(以标准磷30ppm含量为例)。 具体实验数据见表4、图l。 表4现有技术实验结果<table>table see original document page 6</column></row><table>上述表4、图1可以看出，现有技术测定数据波动性大，数值离散不稳定' 本专利技术方法重复性测定吸光度值(以标准磷3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂质体中磷脂含量的测定方法，其特征在于它包括以下步骤：　　ａ、显色剂的制备　　Ａ显色剂：精密称取０．２２克钼酸铵，用蒸馏水溶解后倒入１００毫升的容量瓶中，然后缓慢加入４．７２毫升分析纯硫酸，放凉后稀释定容至刻度，并且倒入棕色瓶中冷藏；Ｂ显色剂：精密称取１５．００克Ｌ－抗坏血酸于烧杯中，用１４％Ｎａ↓［２］ＳＯ↓［３］溶解并定容至１００毫升容量瓶中，倒入棕色瓶中冷藏；　　ｂ、磷标准储备液的配制：精确称取经烘箱干燥的分析纯磷酸二氢钾０．４３９４克溶解转移至１０００毫升容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀既得１００ｕｇ．ｍＬ↑［－１］浓度；　　ｃ、样品溶液配制：精确吸取１．０ｍｌ被测样品脂质体溶液于１０毫升容量瓶中，加水稀释至刻度；　　ｄ、标准曲线绘制精密吸取磷标准储备液０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｍｌ分别置于试管中，得到质量浓度分别为１０、２０、４０、６０、８０、１００ｕｇ．ｍＬ↑［－１］的样品，分别加入０．４毫升１０Ｎ的Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］和０．１毫升３０％Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］消化，将该试管在１７０℃恒温６０分钟；冷却后在每个试管中加入９ｍｌ蒸馏水，混匀后逐个吸取１．５ｍｌ于另一试管，再分别加４．６ｍｌ　Ａ显色剂和０．１ｍｌ　Ｂ显色剂溶液，于１００℃水浴加热１５－２０分钟；冷却后在波长８２２－８３０ｎｍ处比色测定吸收值，以质量浓度ｕｇ．ｍＬ－１为横坐标，吸收值Ａ为纵坐标，绘制标准曲线；　　ｅ、样品的含量测定：　　精密吸取制备的样品溶液０．５ｍｌ于１５×２００ｍｍ试管中，依次加入０．４ｍｌ浓度为１０Ｎ硫酸和３０％过氧化氢溶液０．１ｍｌ消化；温度１７０℃恒温加热６０分钟；冷却后，在每个试管中加入９ｍｌ蒸馏水，混匀吸取１．５ｍｌ于另一试管，再分别加４．６ｍｌ显色Ａ和０．１ｍｌ显色Ｂ溶液，于１００℃水浴加热１５分钟；冷却后在波长在８２２－８３０ｎｍ处比色测定吸收度；将所得样品吸收度数值代入回归曲线方程，求出样品中磷的含量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王永维，刘浩，陈剑琴，张莉，张永祥，刘英华，韩新峰，
申请(专利权)人：华北制药凯瑞特药业有限公司，
类型：发明
国别省市：13[]