一种磁性纳米分子筛及其制备方法和在低丰度蛋白富集中的应用技术

本发明专利技术公开了一种磁性纳米分子筛及其制备方法和在低丰度蛋白富集中的应用。本发明专利技术所提出的磁性纳米分子筛的制备方法操作简单，采用一锅法制备，同时在保证分子筛表面性能，即蛋白吸附性能没有下降的同时，又赋予其磁性；为大规模的样本处理提供了一种更加简单、快速、高效的技术方法。本发明专利技术所提出的基于磁性分子筛的低丰度蛋白的富集，可应用于几乎所有的样本类型，有效解决了质谱检测时高丰度蛋白对低丰度蛋白的鉴定所造成的干扰，蛋白质鉴定数可提高100％

【技术实现步骤摘要】
一种磁性纳米分子筛及其制备方法和在低丰度蛋白富集中的应用


[0001]本专利技术涉及磁性纳米分子筛材料
，具体涉及一种磁性纳米分子筛及其制备方法和在低丰度蛋白富集中的应用。

技术介绍

[0002]蛋白质组学(proteomics)，是以蛋白质组为研究对象，从整体水平上研究蛋白质组成及其变化规律的科学，由此获得蛋白质水平上的关于细胞活动、疾病发生等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学研究不仅能系统地揭示生命活动规律，而且能有效阐明疾病发生发展的分子机制和调控网络。基于液相色谱
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串联质谱(LC
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MS/MS)技术的鸟枪法蛋白质组学(shotgun proteomics)策略为复杂生物样品蛋白质组水平鉴定和定量提供了强有力的技术支撑。
[0003]然而对于一些动态分布范围宽的样本如血清、血浆、尿液、乳汁、脑脊液、唾液、细胞上清液等，基于LC
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MS/MS的蛋白质组学研究受到了极大的限制。以血清或血浆为例，血清/血浆的动态范围分布极宽，估计有12
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13个数量级，大约有22种蛋白质的浓度高达mg/mL，占总蛋白质的99％。而其他的数以千计的人们感兴趣的蛋白质，如组织泄漏蛋白和信号因子，在血浆中的浓度低至ng/mL甚至pg/mL。高丰度的功能蛋白造成的压倒性"掩盖"效应使得有价值的低丰度蛋白的检测非常困难，即使是使用最先进的质谱技术。
[0004]为了提高低丰度蛋白的检出覆盖度，基于免疫亲和力的高丰度蛋白的去除和肽段水平的组分分馏被开发出来。这些方法能够将血浆蛋白的鉴定数提高到500
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800，但去除高丰度蛋白的过程中也会去除一些与高丰度蛋白互作的低丰度蛋白，导致重要的低丰度蛋白信息的损失。此外，该类方法的检测周期长，成本高，通量低；不适用于大规模的队列样本处理。更重要的是，基于抗体的高丰度蛋白去除方法只能针对特定样本类型进行特定蛋白的去除。非血液类样本，如脑脊液、尿液、乳汁、唾液、细胞上清液等样本，其高丰度蛋白种类与血清/血浆样本相差较大甚至完全不同，无法基于以上方法实现高丰度蛋白的去除。因此，迫切需要开发一种不受样本类型限制的、低成本、高通量并且易于操作的新方法，实现低丰度蛋白的快速和高效的富集，从而提高蛋白质的鉴定数。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术针对现有低丰度蛋白富集技术存在的问题，提出了一种磁性分子筛及其制备方法和在低丰度蛋白富集中的应用。本专利技术利用分子筛比表面积大、富含硅羟基的特点，通过其与蛋白质之间的静电作用、氢键作用、以及范德华力等实现各种样本类型中的低丰度蛋白质的富集；本专利技术所提出的磁性分子筛的制备方法，在保证分子筛表面性质不被破坏，分子筛的蛋白吸附性能没有下降的同时，又赋予其磁性；为大规模的样本处理提供了一种更加简单、快速、高效的技术方法，后期可实现高通量自动化生产。此外，该方法应用范围广泛，突破了基于免疫亲和力的高丰度蛋白去除方法的样本类型限制和蛋白质
种类限制。
[0006]技术方案：为达到上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种磁性纳米分子筛的制备方法，包括以下步骤：
[0008]1)将Fe3O4加入柠檬酸钠溶液中，分散均匀后反应，之后分离，洗涤，干燥，得到柠檬酸钠改性的Fe3O4；
[0009]2)取柠檬酸钠改性的Fe3O4加入去离子水中，分散均匀，之后加入碱源，完全溶解；
[0010]3)向2)中加入模板剂、稳定剂与表面活性剂，溶解；
[0011]4)向3)加入硅源和碱金属源，溶解后于室温晶化，之后水热晶化，水热结束后，
[0012]通过过滤，洗涤，干燥，煅烧，即可得到磁性纳米分子筛。
[0013]优选的，步骤1)中，所述的Fe3O4的颗粒尺寸为10～500nm，更优选为20nm；柠檬酸钠溶液浓度为0.01mol/L～1mol/L；所述Fe3O4与柠檬酸钠溶液的的质量比为1：1～100；所述反应的温度和时间为：40～100℃，0.5h～6h；更优选为80℃，1.5h。
[0014]优选的，步骤2)中，所述的碱源为氨水、碱金属化合物、碱土金属化合物、尿素、季胺碱化合物、脂肪胺中的一种或多种；所述Fe3O4：碱源的质量比为Fe3O4：碱源＝1:2～20。
[0015]优选的，步骤3)中，所述的模板剂为三乙胺，二正丙胺，二异丙胺，四丙基氢氧化铵中的一种或多种；所述稳定剂为乙醇，异丙醇，丙三醇、乙二醇中的一种或多种；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，十八烷基二甲基苄基氯化铵中的一种或多种；以Fe3O4的用量作为对比，所述的模板剂，稳定剂，表面活性剂的质量比为Fe3O4：模板剂：稳定剂：表面活性剂＝1:0.1～10:0.05～5:0.01～3。
[0016]优选的，步骤4)中，所述硅源为正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯、正硅酸四正丙酯、正硅酸四正丁酯、硅溶胶、水玻璃、硅藻土中的一种或多种；所述碱金属源为偏铝酸钠，氯化铝，硫酸铜，氯化铜，硫酸锌，氯化锌中的一种或多种；以Fe3O4的用量作为对比，所述硅源，碱金属源的质量比为Fe3O4：硅源：碱金属源＝1:20～100:1～20；所述室温晶化时长为1～6h，所述水热晶化的温度为100～200℃，时长为24～120h。
[0017]本专利技术还提供了一种磁性纳米分子筛材料，由上述制备方法制得。所述的磁性纳米分子筛材料为Fe3O4型分子筛，Fe3O4被分子筛外壳所包覆。
[0018]本专利技术还提供了所述的磁性纳米分子筛在低丰度蛋白富集中的应用。
[0019]本专利技术最后提供了利用所述的磁性纳米分子筛富集低丰度蛋白的方法，包括以下步骤：
[0020]1)向待测样本中加入结合缓冲液和磁性纳米分子筛，得到混悬液；
[0021]2)将所述混悬液震荡孵育后，进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；
[0022]3)加入清洗缓冲液洗涤沉淀，所得沉淀即为磁性纳米分子筛及其所富集的低丰度蛋白的混合物；
[0023]4)采用质谱、IHC、Elisa、Western blot或化学发光对目标蛋白质组或目标蛋白进行检测。
[0024]优选的，所述的待测样本类型选自血液、尿液、脑脊液、唾液、乳液、蛋清或细胞上清液；所述磁性纳米复合材料和待测样本的比例为1mg：5ul～10ml
[0025]优选的，步骤1)中，所述结合缓冲液的成分包括Tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥
酸、巴比妥钠、氢氧化钠、盐酸、甲酸、乙酸、EDTA、SDS、NP
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40、CHAPS、吐温、Triton、PEG、乙腈、甲醇的中的一种或任意组合，优选为Tris、EDTA的组合缓冲液。
[0026]优选的，步骤2)中，所述震荡孵育的条件为：18～37℃，500～2000rpm，孵育1～120min；所述置于磁力架上，放置时间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磁性纳米分子筛的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将Fe3O4加入柠檬酸钠溶液中，分散均匀后反应，之后分离，洗涤，干燥，得到柠檬酸钠改性的Fe3O4；2)取柠檬酸钠改性的Fe3O4加入去离子水中，分散均匀，之后加入碱源，完全溶解；3)向2)中加入模板剂、稳定剂与表面活性剂，溶解；4)向3)加入硅源和碱金属源，溶解后于室温晶化，之后水热晶化，水热结束后，通过过滤，洗涤，干燥，煅烧，即可得到磁性纳米分子筛。2.根据权利要求1所述的磁性纳米分子筛的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的Fe3O4的颗粒尺寸为10～500nm；柠檬酸钠溶液浓度为0.01mol/L～1mol/L；所述Fe3O4与柠檬酸钠的质量比为1：1～100，所述反应的温度和时间为：40～100℃，0.5h～6h。3.根据权利要求1所述的磁性纳米分子筛的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的碱源为氨水、碱金属化合物、碱土金属化合物、尿素、季胺碱化合物、脂肪胺中的一种或多种；所述Fe3O4：碱源的质量比为Fe3O4：碱源＝1:2～20。4.根据权利要求1所述的磁性纳米分子筛的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的模板剂为三乙胺，二正丙胺，二异丙胺，四丙基氢氧化铵中的一种或多种；所述稳定剂为乙醇，异丙醇，丙三醇、乙二醇中的一种或多种；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，十八烷基二甲基苄基氯化铵中的一种或多种；以Fe3O4的用量作为对比，所述的模板剂，稳定剂，表面活性剂的质量比为Fe3...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵娜，马聪聪，陈亮宇，李捷，
申请(专利权)人：谱天天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：