一种白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用。本发明专利技术筛选得到的白蚁菌Isoptericolasp.WL6属于嗜碱的极端微生物，可在高碱性条件下(pH9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。本发明专利技术的白蚁菌Isoptericola sp.WL6产生的碱性木聚糖酶蛋白分子量为43kD左右，酶学特性研究显示，其最适反应温度为50℃，最适反应pH为8左右，特别是在pH6.5～10.5之间，该酶的相对酶活力均在80％以上，说明该酶pH稳定性良好，具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性，符合造纸和洗涤等工业用酶的基本要求，具有良好的工业应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用。

技术介绍

[0002]木聚糖是自然界中含量最丰富的半纤维素，几乎在所有植物组织中都有发现，它是一种主要存在于植物细胞的细胞壁中的复杂分子。该聚合物的主链由β
‑
1,4糖苷键连接的D
‑
吡喃木糖残基组成。侧链连接有各种短的基团，侧链上的取代基以L
‑
Arabinose、FerulcAcid、AcetyL、Coumaricacid和Glcuronicacid的残基形式存在，因此不同木聚糖的结构和化学组成差异很大。由于其结构的复杂性，想要将其完全转化为单糖，需要多种具有不同功能和作用方式的水解酶协同作用才能完成。
[0003]木聚糖酶是指能够将木聚糖水解成寡糖或单糖的一系列酶的总称，包括内切β1,4
‑
D
‑
木聚糖酶(endo
‑
1,4
‑
β
‑
D
‑
xylnxylnohydrolse，EC.3.2.1.8)、β
‑
D
‑
木糖苷酶(β
‑
xylnxylhydrolse，EC.3.2.1.37)、α
‑
L阿拉伯糖苷酶(α
‑
arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)、α
‑
D
‑
葡糖苷酸酶(α
‑
glcuronidase，EC3.2.1.139)、乙酰基木聚糖酶(α
‑
glcuronidase，EC3.2.1.139)等。狭义上的木聚糖酶单指内切β
‑
1,4
‑
D木聚糖酶，它能够催化木聚糖的主链内β
‑
1,4
‑
糖苷键的水解，切割木聚糖主链的β
‑
1,4
‑
糖苷键，生成木寡糖或带有侧链的寡聚木糖，从而降低木聚糖的聚合度，将木聚糖水解成低聚木糖，因此，内切木聚糖酶也称作木聚糖水解的关键酶。
[0004]工业上利用木聚糖酶还存在一些问题:稳定性低、底物特异性差，酶活性范围窄，限制了木聚糖酶的广泛应用，大多数报道的GH10木聚糖酶不能耐受超过50℃的温度。研究嗜极微生物已被证明是发现稳定性更高的新型酶的有效策略，同时，为使筛选得到的木聚糖酶能进行大规模生产，通常需要利用基因工程的手段实现木聚糖酶的异常源表达，探索更加有效的表达系统最终实现大规模发酵生产，以满足工业应用的要求。此外，借助高通量设备，计算机软件辅助的方式，从分子进化角度深度探索酶结构与功能的关系，也是近年来的研究热点之一。理性设计和定向进化方法已被广泛用于改善木聚糖酶的性能，国内外的相关研究也已取得重要研究进展。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种白蚁菌Isoptericola sp.WL6，该白蚁菌可产生一种碱性木聚糖酶。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供上述白蚁菌Isoptericola sp.WL6产生的碱性木聚糖酶。该酶具有pH适应范围广，耐热、碱、金属离子和表面活性剂等适用于造纸、洗涤等工业的优良酶学特性。
[0007]本专利技术的再一目的在于提供上述白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶的应用。
[0008]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0009]一种白蚁菌，是从土壤中筛选得到的一株具有产碱性木聚糖酶活力的菌株Isoptericola sp.WL6。
[0010]所述的白蚁菌的保藏编号为CCTCC NO:M 20221888，于2022年12月07日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
[0011]菌落形态特征：在LB固体培养基上的菌落边缘较为整齐，颜色为淡黄色，表面平滑有光泽。
[0012]该菌株的选择培养基的配方：木聚糖8.0g/L，KNO
3 1.0g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，NaCl 15g/L，KH2PO41.5g/L，琼脂15～20g/L，pH9.0。
[0013]所述的白蚁菌Isoptericola sp.WL6产生的碱性木聚糖酶，按照下述方法制得：
[0014](1)粗酶液的制备
[0015]将白蚁菌Isoptericola sp.WL6在发酵培养基中进行液体发酵，在37℃，200rpm的培养条件下发酵7d，于4℃，12000rpm高速冷冻离心25min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，透析，即得粗酶液，用于离子交换层析；
[0016](2)碱性木聚糖酶的分离纯化
[0017](a)层析柱的装填
[0018]在规格为Φ2.6cm
×
30cm的层析柱中倒入100mL搅拌均匀的阴离子交换层析介质SP
‑
Sepharose Fast FLow层析凝胶，随后将层析柱安装至GE healthcare快速蛋白层析系统。用去离子水以2mL/min的流速冲洗层析柱15min，随后用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待A280紫外吸收峰基线稳定后封闭柱头，完成层析柱的装填。
[0019](b)内切木聚糖酶的阴离子离子交换层析
[0020]将装填好的层析柱安装至GE healthcare快速蛋白层析系统，以pH6.5的tris
‑
HCl溶液为平衡缓冲液，pH6.5，含1M NaCl的tris
‑
HCl溶液为洗脱缓冲液，进行蛋白的分离纯化。上样前使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将A280基线冲洗稳定后，取5mL经0.22nm微孔滤膜过滤后的发酵液上样，继续用平衡缓冲液洗至穿透峰出现，待A280基线平稳时，转换为洗脱缓冲液，以不同的盐浓度梯度冲洗层析柱进行梯度洗脱。使用2mL EP管分别收集不同盐浓度紫外吸收峰下的洗脱液，并使用DNS法对各管洗脱液进行木聚糖酶活检测。
[0021](c)粗酶液的脱盐处理
[0022]使用脱盐柱，将收集到的粗酶液进行脱盐，将脱盐柱安装至GE healthcare快速蛋白层析系统，使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将离子浓度基线冲洗稳定后，取10mL经0.22nm微孔滤膜过滤后的粗酶液上样，继续使用平衡缓冲液进行洗脱至A280基线出现波动时，取20mL离心管收集A280洗脱液，待离子浓度基线升高时停止接样，得到碱性木聚糖酶粗酶液。将粗酶液进行SDS
‑
PAGE蛋白电泳分析，4℃保存，用于后续的凝胶过滤层析。
[0023](d)碱性木聚糖酶的凝胶过滤层析
[0024]将粗酶液倒入10KDa超滤浓缩管进行超滤浓缩后，使用预装柱Superdex200将粗酶液再次进行分离。缓冲体系为pH 8.0的去离子水，用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白蚁菌，其特征在于：名称为Isoptericola sp.WL6，保藏编号为CCTCC NO:M 20221888，于2022年12月07日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。2.一种碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述的碱性木聚糖酶按照下述方法制得：(1)粗酶液的制备将白蚁菌Isoptericola sp.WL6在发酵培养基中进行液体发酵，离心取上清液，经过滤，透析，即得粗酶液，用于离子交换层析；(2)碱性木聚糖酶的分离纯化(a)层析柱的装填在规格为Φ2.6cm
×
30cm的层析柱中倒入100mL搅拌均匀的阴离子交换层析介质Q
‑
Sepharose Fast FLow层析凝胶，随后将层析柱安装至GE healthcare快速蛋白层析系统；用去离子水以2mL/min的流速冲洗层析柱15min，随后用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待A280紫外吸收峰基线稳定后封闭柱头，完成层析柱的装填；(b)内切木聚糖酶的阴离子离子交换层析将装填好的层析柱安装至GE healthcare快速蛋白层析系统，以pH6.5的tris
‑
HCl溶液为平衡缓冲液，pH6.5，含1M NaCl的tris
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HCl溶液为洗脱缓冲液，进行蛋白的分离纯化；上样前使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将A280基线冲洗稳定后，取5mL经0.22nm微孔滤膜过滤后的发酵液上样，继续用平衡缓冲液洗至穿透峰出现，待A280基线平稳时，转换为洗脱缓冲液，以不同的盐浓度梯度冲洗层析柱进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘森林，张文斌，陈伟钊，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：