重组烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种重组烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法。本发明专利技术首先构建烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌；然后采用高密度发酵培养基(氮源含量低)对工程菌进行分批补料高密度发酵，再经两次IPTG诱导产生烟酰胺核糖激酶，发酵结束时菌体湿重达到240g/L以上，将菌体破碎后进行酶活检测，其单位酶活达到90U/mL以上，总酶活达到11万U以上，其发酵方法具有发酵成本低、菌体及酶活产量高、发酵稳定性好的特点。定性好的特点。定性好的特点。

【技术实现步骤摘要】
重组烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法


[0001]本专利技术属于发酵工程
，具体涉及重组烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法，本专利技术还涉及其高密度发酵培养基。

技术介绍

[0002]烟酰胺单核苷酸(β
‑
NMN)是天然存在于人体内的NAD
+
的前体物质，通过转化为NAD
+
为人体提供能量，可减缓细胞衰老及维持氧化还原状态，被广泛应用于人体保健等领域。生物酶法具有底物专一性高、反应条件温和、催化效率高、过程简单且容易控制和环境友好等优点，成为目前生产β
‑
NMN的主要方法。烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase，NRK)可特异性催化烟酰胺核糖(NR)和三磷酸腺苷(ATP)，并且在辅因子Mg
2+
参与下生成β
‑
NMN和ADP。该反应体系中只需要NR参与合成反应，具有反应简单、底物便宜、成本低、物料少、中间产物少、产物分离纯化比较容易等优点，有工业化应用优势。
[0003]目前，对于烟酰胺核糖激酶的研究多集中于酶的分子改造及单位酶活提高方面。然而，通过高密度发酵提高菌体湿重对于获得高产量的烟酰胺核糖激酶的总酶活具有重要作用。因此，对于已构建的烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌的高密度发酵培养基及发酵方法方面还有待进一步探究。
[0004]CN114107160 A公开了一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌及其在合成β
‑
烟酰胺单核苷酸中的应用，所述工程菌是将烟酰胺核糖激酶基因转入大肠杆菌宿主菌构建获得，工程菌发酵培养基采用无机盐培养基，组成为：12g/L蛋白胨，14g/L酵母膏，5g/L无水甘油，2g/L KH2PO4，16g/L K2HPO4·
3H2O，溶剂为水，pH6.5
‑
6.8。经HPLC测定，合成β
‑
烟酰胺单核苷酸的最大浓度达到86.9g/L，底物烟酰胺核糖氯化物的转化率达到94％以上。
[0005]CN114990088 A公开了一种烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与NMN的制备方法，其利用烟酰胺核糖激酶突变体酶法合成β
‑
烟酰胺单核苷酸，显著提高了合成β
‑
烟酰胺单核苷酸的产量和转化率，其工程菌发酵培养的培养基，包括大豆肽2g/L、胰蛋白胨10g/L、甘油8g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、(NH4)2SO
4 2.5g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、MgSO4·
7H2O 0.5g/L、K2HPO4·
3H2O 9.82g/L、KH2PO
4 3.0g/L、Na2HPO4·
12H2O 15.13g/L。
[0006]CN113980929 A公开了一种分泌表达毕赤酵母内源烟酰胺核糖激酶的方法及其应用，将毕赤酵母来源的烟酰胺核酸激酶基因连接至表达载体，接着导入酵母宿主细胞，能够高水平表达烟酰胺核酸激酶，并且由于是分泌表达，避免了破胞处理后胞内杂蛋白对后续纯化的影响，这有利于NMN的下游纯化，同时降低NMN酶法催化的生产成本，其工程菌发酵采用BMGY培养基，具体成分为：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO
4 3g/L，KH2PO
4 11.8g/L，酵母基础氮源(YNB)3.4g/L，(NH4)2SO
4 10g/L，生物素4
×
10
‑4g/L，甘油10mL/L。
[0007]上述专利文献中发酵水平均不是高密度发酵，而且用于大肠杆菌工程菌培养的普适性培养基存在氮源含量高、发酵成本高、配方成分复杂、微量元素不好配置，并且不一定适合已构建的烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌高密度发酵等问题。
ttctccctcc tcactcctct gtattttcca gcaggcttgt atttccctgt tattttgtat tgatagggaa gtgcggcatt ttttccaccc acttttttct tgcatcctac attttgacaa aacgttgttt cggcgttttt ccacctagaa acgatgtaca atagctctga tgtacttctc gtcggagtaa ggtaagtaaa ttacactcaa aagtgtgggc aggctgttga attccatctt ccgaatgcgt attctgcaga atagttacta acaagtataa acagcggtgc ttcctgcagc ggaaaatcgg tatgaaaaac ttgtttgttt gctttgtctc atagcaactc ttctctctga ctcactggaa gacactgtgt cagctgctgc atgctgtcta tgacaattcg atcattctgc acgaagacga cttctataag gtttgtccta tctgacccgt gttaatcaca catgatgctg acagtgattc ctctgtgtat agacggatgc tttgatcccc attcacgatg gttacatgga ttgggattgc gtagatgcca ttgactttcc taaatttcat gaagcactcg tgtacattaa gcagcacggt gaattgccaa aatggctgct cgaaaaagaa gcaaaccaga atgttgccac gaaagcagtt gtagaatacg ctgatgtagt ccaggccggc cggagtttag ttactcaaca gcctggaaag aagattattc tcgttgacgg gttcatgctt tatgtctcca accagctgat tgactctttt gacgtacgta tcatgctgcg agcagattac aatgtcctca aacaacgacg tgaagcacgc actggctatg ttacgacaga aggtagtaga ccggcacatc tttccccaac agagaagtgt attttcatta ttagtttcca ggagcgacac aacatgctaa ctgtttctat ataggcttct ggcaagaccc cccgggatac tttgataagt tcgtttggcc cggatacaag gaaggccacc agcacctgtt tgaaaacgac aatgttgagg gccgtatcat agatcctcgc atcaacatca ctcacagaaa cgacatgact gtgtatgaga acctcgtctg gaccatcgaa ttgttacagc atcatcttca gtaaacccac gctaatcagt tttttcctac atttcttgac aaagttctta tacccagttg tgtcccctta a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌，其特征是，将烟酰胺核糖激酶基因，通过pET
‑
30a(+)载体转入宿主菌大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS构建获得，所述烟酰胺核糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的一种重组烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌，其特征是，选择酶切位点为EcoR I、BamHI，在目的基因上游87bp，下游72bp的地方设计烟酰胺核糖激酶的上下游引物，PCR扩增获得带有酶切位点的烟酰胺核糖激酶基因；表达载体pET
‑
30a(+)经EcoR I、BamHI酶切后，同源重组上述扩增的带有酶切位点的烟酰胺核糖激酶基因，转化宿主菌大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS，得到重组烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌BL21Star(DE3)pLysS/pET
‑
30a(+)
‑
NRK。3.权利要求1或2所述的重组烟酰胺核糖激酶大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法，其特征是，其采用分批补料高密度发酵方式；其发酵培养基组成为：2.7～5.0g/L酵母浸粉、2.5～5.0g/L蛋白胨、7.2～10.0g/L葡萄糖
·
H2O、2.5～5.0g/L(NH4)2SO4、5.3～8.35g/L K2HPO4·
3H2O、2.5～3.0g/L KH2PO4、9.0～12.86g/L Na2HPO4·
12H2O、2.1～3.0g/L柠檬酸
·
H2O、0.5～1.0g/L MgSO4·
7H2O。补料组成为：30.0～45.8g/L酵母粉、20.8～31.25g/L蛋白胨、450～500g/L葡萄糖
·
H2O。4.如权利要求3所述的高密度发酵方法，其特征是，将工程菌的二级种子按照体积比5～10％的接种量接种发酵培养基中进行分批补料高密度发酵24～26h，培养温度为33～37℃；当发酵过程中OD
600
＝20～30时，降低培养温度为25～28℃，第一次添加0.05～0.15mM的IPTG诱导剂进行产酶，产酶时长为18～20h；当菌体浓度OD
600
＝40～50时，第二次添加0.05～0.15mM IPTG诱导剂进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘灿珍，刘鹏，刘凯，王硕，王澜婷，
申请(专利权)人：广西天铭药业有限公司，
类型：发明
国别省市：