分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用。本发明专利技术首先以SVA CH/FJ/2017毒株基因序列为基础，构建SVA VP2蛋白重组表达质粒pET28a

【技术实现步骤摘要】
分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用。

技术介绍

[0002]A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)隶属小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，是一种新发猪传染病病原。SVA主要感染猪，且对不同年龄阶段的猪都易感，主要引起母猪严重的水疱病和新生仔猪的死亡，新生仔猪病死率高达30％～70％。SVA感染后主要临床症状为猪鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位的皮肤、黏膜出现水疱样病变，与口蹄疫(FMD)、猪水疱疹(VES)、猪水疱病(SVD)和水疱性口炎(VS)引起的病变极为类似，临床上难以区分。猪塞内卡病毒病的暴发与流行已给全球养猪业造成了较大的经济损失。
[0003]相比较其它病原，SVA的研究较少，在蛋白免疫原性方面也处于起始阶段。虽然已有报道关于SVA的灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等多种候选疫苗的研究进展，但目前仍无商品化疫苗用于预防SVA感染。SVA感染动物机体后，可以同时激活机体的B细胞和T细胞应答，从而产生大量的中和抗体抵抗和清除SVA的感染。已有研究证实小鼠是初步评价SVA疫苗免疫原性和保护效果的候选动物模型；孟媛等利用重组SVA VP1蛋白联合佐剂免疫小鼠评价了其免疫应答效果；崔川等融合表达了SVA VP2蛋白并在免疫VP2蛋白的小鼠血清中检测到高水平的特异性抗体和IFN
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γ、IL
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2细胞因子含量。SVA VP2结构蛋白作为诱导机体生成中和抗体的优势抗原，是SVA亚单位疫苗和诊断制剂研究候选抗原之一，制备可溶性、高活性的重组VP2蛋白是亚单位疫苗研究的关键。
[0004]通过体外表达系统制备重组蛋白时，大肠杆菌表达系统因操作简单、生产成本低、表达量高等优点常为首选的表达系统，但大多重组蛋白多以包涵体形式表达，主要原因是蛋白在形成过程中快速聚集，肽链折叠时间短，造成肽链折叠不充分、不完全，从而产生异常构象，形成包涵体。先前的研究表明SVA VP2蛋白的外源性表达多以包涵体形式存在，可能导致蛋白质无法正确折叠，从而影响其正常生物学功能。其中张永宁等和崔川等通过在VP2蛋白的编码基因中添加融合标签，分别利用原核表达载体pET
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30a和pET
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32a制备了可溶性表达的SVA VP2蛋白，但这种方式制备的重组蛋白的分子量明显大于正常的VP2蛋白，对准确研究VP2蛋白的功能可能存在一定影响。
[0005]分子伴侣蛋白是高度保守的蛋白质，在体内促进其他蛋白质的适当折叠。不同的伴侣系统有助于蛋白质从头折叠、运输和低聚物复合物的组装，以及从应激诱导的展开中恢复。也有研究表明分子伴侣能够提高目的蛋白的可溶性表达，但是分子伴侣促进目的蛋白可溶性表达的结果也存在一定的随机性，相反可能会抑制其他酶或蛋白的可溶性表达；而且在蛋白纯化过程中分子伴侣污染现象严重。而且本专利技术在研究过程中发现，大多数的分子伴侣(例如pG
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KJE8，pGro7，pKJE7，pG
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Tf2等)均未使A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶
性表达。
[0006]触发因子(Trigger Factor，TF)作为一种核糖体相关的伴侣蛋白，在核糖体释放新生肽链出口处可与大部分的新生肽链结合，形成一个受保护的折叠空间，使得新生肽链不受前导和聚集的影响进而折叠为正常构象的成熟蛋白质。虽然已经有文献公开了分子伴侣TF对其他病毒中VP2蛋白的可溶性表达研究，但是由于病毒种类不同，VP2蛋白的差异也较大，导致其可溶性表达的结果存在相反性。例如，文献(4种分子伴侣促进猫细小病毒样颗粒可溶性表达的研究)发现，分子伴侣pTf16(TF)均能促进FPV VP2蛋白的可溶性表达；文献(5种分子伴侣对水貂阿留申病毒核衣壳蛋白VP2部分基因可溶性表达的影响)发现pTf16(TF)伴侣蛋白与水貂阿留申病毒核衣壳蛋白VP2共表达，未见可溶性蛋白增加，表明pTf16(TF)不能促进水貂阿留申病毒核衣壳蛋白VP2的可溶性表达。

技术实现思路

[0007]针对上述问题，本专利技术利用SVA VP2蛋白重组质粒与分子伴侣蛋白Trigger Factor(TF)表达质粒pTF16共表达，成功实现SVAVP2蛋白的可溶性表达。纯化出可溶性的重组VP2蛋白，通过免疫小鼠，系统分析该重组蛋白诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答水平，研究结果证明本研究制备的重组VP2蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，为开发SVA新型亚单位疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础。
[0008]具体包括以下内容：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种分子伴侣蛋白Trigger factor在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2表达中的应用。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种可溶性表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的基因工程菌，所述基因工程菌含有表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的质粒和表达分子伴侣Trigger factor的质粒。
[0011]优选地，所述方法包括：将表达分子伴侣Trigger factor的质粒与表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的质粒共同转化宿主细胞，获得可同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌。
[0012]第三方面，本专利技术提供了一种可溶性表达重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的方法，所述方法包括：将同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌进行发酵培养，诱导表达获得重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。
[0013]优选地，所述方法包括如下步骤：
[0014]基因工程菌的制备：制备同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌；
[0015]诱导表达：将获得的基因工程菌进行发酵培养，加入L
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阿拉伯糖和IPTG诱导表达获得重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。
[0016]优选地，所述基因工程菌的制备包括如下步骤：
[0017](1)对A型塞内卡病毒结构蛋白VP2基因密码子进行大肠杆菌密码子优化，合成SVA VP2基因并连接到大肠杆菌表达载体，构建重组表达质粒；
[0018](2)将分子伴侣pTF16质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选制备感受态细胞；
[0019](3)将步骤(1)所述的重组质粒转入步骤(2)感受态细胞，筛选获得同时表达A型塞
内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌。
[0020]优选地，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分子伴侣蛋白Trigger factor在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2表达中的应用。2.一种可溶性表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的质粒和表达分子伴侣Trigger factor的质粒。3.一种可溶性表达重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的方法，其特征在于，所述方法包括：将同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌进行发酵培养，诱导表达获得重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：基因工程菌的制备：制备同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌；诱导表达：将获得的基因工程菌进行发酵培养，加入L
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阿拉伯糖和IPTG诱导表达获得重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的制备包括如下步骤：(1)对A型塞内卡病毒结构蛋白VP2基因密码子进行大肠杆菌密码子优化，合成SVA VP2基因并连接到大肠杆菌表达载体，构建重组表达质粒；(2)将分子伴侣pTF16质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选制备感受态细胞；(3)将步骤(1)所述的重组质粒转入步骤(2)感受态细胞，筛选获得同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI69...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，茹毅，杨锐，郝荣增，李亚军，杨洋，张贵财，任蕊芳，毛玉涵，张越，卢炳洲，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：