斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及水产动物免疫学，具体涉及一种具有免疫保护性的斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗、及其制备方法和应用。该疫苗的抗原序列是如SEQ ID NO:1所示的多肽，其可以通过构建表达载体、转化到大肠杆菌中进行诱导表达并分离纯化得到，其对斑点叉尾鮰的保护率超过85％，已经作为一种疫苗和药物用于斑点叉尾鮰的养殖中。的养殖中。

【技术实现步骤摘要】
斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及水产动物免疫学，具体涉及一种具有免疫保护性的斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗、及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]斑点叉尾鮰又称沟鲶，是鮰科、真鮰属鱼类，属大型鱼类原产于美国。八十年代中期由湖北省水产研究所率先引进，随后在全国被广泛养殖，现已成为发展外向型渔业的重要养殖品种。近年来，随着养殖规模的不断扩大和养殖密度的不断提高，斑点叉尾鮰病害频发，且病症有愈发复杂的趋势，给广大养殖户造成了巨大的经济损失，以前斑点叉尾鮰的病害研究大多集中在细菌、真菌和寄生虫等病原，对病毒性的研究甚少。
[0003]2020年江苏、湖北、浙江等养殖区内斑点叉尾鮰连续爆发出急性且高致死率的出血病，患病表现症状为鱼体表颜色加深、出血；肝脏、脾脏和肾脏坏死或出血等症状。该病传播迅猛，抗生素治疗无效，针对这一现象，申请人从江苏、湖北两地进行采样，通过高通量测序方法对具有明显病症的斑点叉尾鮰样本的肾脏、脾脏、肾脏组织进行测序分析，组织切片观察、细菌培养筛查、人工感染实验等实验，最终鉴定出该致病性病原为单链RNA病毒，目前关于该病毒的研究甚少。

技术实现思路

[0004]通过对该单链RNA病毒研究，制备得到了该小RNA病毒的疫苗，其抗原序列为如SEQ ID NO:1所示的多肽。
[0005]该抗原序列是通过高通量测序、宏基因组测序、蛋白质组鉴定、NetCTL、WAPP及BepiPred1.0 Serever软件进行蛋白质结构和功能分析所得，免疫斑点叉尾鮰后感染试验验证，其可以有效的保护斑点叉尾鮰免受斑点叉尾鮰小RNA病毒的伤害，并且保护率能达到85％以上。
[0006]本专利技术的目的之二在于保护编码上述斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列。其中，优选的，该核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本专利技术的目的之三在于保护含有上述核苷酸序列的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、重组质粒、工程菌。
[0008]本专利技术的目的之四在于保护上述斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：扩增能够编码斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列，构建重组表达质粒，并转化到大肠杆菌细胞中进行诱导表达，分离纯化后即得。
[0009]优选的，重组表达质粒先转化到大肠杆菌DH5α感受态后再进行提取，提取后再转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行诱导表达。
[0010]优选的，构建重组表达质粒时所用的质粒为pET32a。
[0011]本专利技术的目的之五在于保护上述疫苗、核苷酸序列在制备保护斑点叉尾鮰免受斑点叉尾鮰小RNA病毒伤害的制剂中的应用。
[0012]本专利技术的目的之六在于保护上述疫苗、核苷酸序列在保护斑点叉尾鮰免受斑点叉尾鮰小RNA病毒伤害中的应用。
[0013]本专利技术以斑点叉尾鮰小RNA病毒衣壳蛋白上的一段序列作为抗原制备得到亚单位疫苗，其抗原是中和性抗原蛋白，不是灭活或者减毒疫苗，能够有效的保护斑点叉尾鮰免受该病毒的伤害，且保护率能达到85％。该疫苗与其他疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗等)相比，不含病毒成分，生产和使用过程不会存在病毒抗原丢失、抗原结构被破坏的问题，无传染病毒可能性，也不会存在核酸DNA可能诱导产生自身免疫反应，导致机体对抗原产生免疫耐受性的问题，并且该疫苗免疫特异性强、重复性好、成本低且安全；该疫苗目前已经被成功用于斑点叉尾鮰的养殖中。
附图说明
[0014]图1为实施例2中目的基因PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果；
[0015]图2为实施例2中表达载体pET 32a酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果；
[0016]图3为实施例2中重组基因转进DH5α后单克隆菌落PCR后的琼脂糖凝胶电泳结果；
[0017]图4为重组蛋白诱导、表达后的SDS
‑
PAGE凝胶电泳结果；
[0018]图5为重组蛋白诱导、表达后的Westernblot检测结果；
[0019]图6为表达产物纯化过程的SDS
‑
PAGE凝胶电泳结果；
[0020]图7为表达产物纯化过程的Westernblot检测结果。
具体实施方式
[0021]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0022]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0023]在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0024]质粒DNA小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、菌落PCR试剂、所有限制性内切酶、连接酶、一步克隆试剂、2
×
Es Taq MasterMix(含染料)、Taq DNA聚合酶、KOD Plus NEO KOD
‑
401、10
×
PCR Buffer、dNTPs、DNA marker、HRP
‑
conjuated Mouse anti His
‑
Tag mAb抗体皆购自Takara宝生物工程(大连)有限公司。
[0025]LB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母浸出物、10g氯化钠(制备平板时加入20g琼脂粉)，溶于ddH2O，1mol/L NaOH调pH值至7.0
‑
7.5，定容至1000mL，121℃高压下蒸气灭菌20min，4℃保存备用。
[0026]实施例1
[0027]从江苏、湖北两地的养殖区采集具有明显病症的斑点叉尾鮰样本，进行致病性病原鉴定。结果显示，患病斑点叉尾鮰鱼体表颜色加深、出血，肝脏、脾脏和肾脏有坏死或出血症状。进一步经过测序分析、组织切片观察、细菌培养筛查，人工感染实验等，最终鉴定出该
致病性病原为单链RNA病毒，进一步利用宏基因组测序、蛋白质组鉴定、NetCTL、WAPP及BepiPred1.0Serever软件进行蛋白质结构和功能分析，最终得到该病毒衣壳蛋白的优化核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。SEQ ID NO:1：MSSKIECPTQPEVESSELTCWDWSPLLLRSLADYIEVQAL KKKGLVFHILNKCRAIPGSISYSLVNRFKTVLMYFFPKMKCFRGKRTDLVEPITVVSMGTSFNGFLTPQNEFYCPDFYGESITLSDPPRPRLLELRGDTGGCSITCRACGVKIKKSNLLKHLQVCPKRTQPPRPPCPPKMTYKKTPAGQLKVKQAGPKQIAPIPMRDDPKGKGRWWI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原是序列如SEQ ID NO:1所示的多肽。2.编码斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的编码斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.含有权利要求2或3所述的核苷酸序列的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、重组质粒、工程菌。5.权利要求1所述的斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：扩增能够编码斑点叉尾鮰小RNA病毒亚单位疫苗抗原的核苷酸序列，构建重组表达质粒，并转化到大肠杆菌细胞中进行诱导表达，分离纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莉，柳芹，
申请(专利权)人：武汉华扬天乐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：