一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白表位肽、筛选方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白表位肽、筛选方法及应用，涉及生物技术领域，所述表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4和/或SEQ IDNO：6，通过生物信息学法和/或重叠肽法进行互补筛选，所述表位肽可以用于研发柯萨奇病毒A10型表位疫苗，用于制备柯萨奇病毒A10特异性抗体，用于制备诊断或检测柯萨奇病毒A10型感染试剂。染试剂。染试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白表位肽、筛选方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白 表位肽、筛选方法及应用。

技术介绍

[0002]手足口病(hand,footandmousedisease,HFDM)是由多种肠道病毒引起的 常见儿童传染病，临床表现为发热、手、足、臀部皮疹、疱疹及口腔黏膜溃 疡等，多为自限性症状，少数患儿可继发脑炎、脑膜炎、心肌炎，严重可引 起急性迟缓性麻痹、神经源性肺水肿及肺出血等神经系统并发症，甚至危及 患儿生命。肠道病毒A组71型(enterovirus71,EV
‑
A71)和柯萨奇病毒A组 16型(coxsackievirusA16,CV
‑
A16)是引起手足口病的主要病原体，但近年 来流行病学研究表明，柯萨奇病毒A组10型(CV
‑
A10)感染引起的手足口 病呈上升趋势。自2008年，芬兰首次出现由CV
‑
A10感染HFDM流行后， 世界各地相继报道CV
‑
A10的流行，CV
‑
A10已成为引起HFDM的肠道病毒 重要型别。
[0003]CV
‑
A10隶属于小RNA病毒科、肠道病毒属A组，与其他型肠道病毒 一致，其电镜下分子结构为正二十面体对称球形，由60个亚单位构成，每 个亚单位包含VP1、VP2、VP3及VP4四种结构蛋白(viralprotein,VP),构 成病毒颗粒衣壳。VP1、VP2和VP3蛋白暴露于病毒成熟颗粒外部，是病毒 抗原表位的主要所在区域，其中VP1蛋白在不同组别的肠道病毒间具有抗原 特异性，是病毒型别鉴定及分型的主要区段；VP4蛋白包埋于病毒颗粒内部 与病毒核心相连。CV
‑
A10基因组全长7.4kb，仅含有一个开放阅读框(ORF)， 编码一个多聚前体蛋白，可水解为P1～P3三个前体蛋白，其中P1前体蛋白 编码VP1～VP4四个结构蛋白，P2和P3前体蛋白编码2A～2C和3A～3D七 个非结构蛋白，其中2A和3C蛋白具有特异性水解酶作用，切割病毒RNA 的编码蛋白；2B和3A蛋白协助RNA复制；2C蛋白参与能量供给过程；3B 蛋白结合在5
’
端非编码区，参与VPg加工和合成；3D蛋白是RNA聚合酶 病毒基因组的关键酶。
[0004][0005]CV
‑
A10引发的HFDM的流行和病毒的不断进化，目前缺乏有效的疫苗 和抗病毒药物，而研发疫苗是当前最可靠的预防CV
‑
A10暴发的手段。Zhang 等对甲醛灭活的CV
‑
A10全病毒疫苗进行评价，其产生的抗血清中具有高度 的中和抗体效价，且具有体内免疫保护作用；使用β
‑
丙内脂灭活的CV
‑
A10 原性株(Kowalik)和CV
‑
A10/S0148b分离株的实验用疫苗均可诱导小鼠产 生CV
‑
A10特异性抗血清，其研究表明两种实验用灭活疫苗均对CV
‑
A10同 源病毒株的感染起到中和作用，且具有一定的体内免疫保护作用 [ZhangZ,DongZ,LiJ,etal.ProtectiveEfficaciesofFormaldehyde
‑
InactivatedWhole
‑ꢀ
VirusVaccineandAntiviralsinaMurineModelofCoxsackievirusA10Infection[J].JVi rol,2017；91.]。病毒样颗粒(virus
‑
likeparticles,VLP)疫苗在CV
‑
A10中也已 有研究，基于CV
‑
A10原性株(Kowalik)和CV
‑
A10/S0148b分离株的VLP 疫苗可有效诱导小鼠产生特异性抗体且具有免疫保护作用。这表明 CV
‑
A10VLP疫苗具有巨大潜力可用于后期多价疫苗的研发，但仅针对原型 株和特定分离株的CV
‑
A10VLP疫苗对具有其他基因型的CV
‑
A10是否可起 到保护作用
VP1区蛋白线性中和表位进行综合筛选，并通过微量中和实验对筛 选出的表位肽基于的候选表位疫苗抗血清中和抗体滴度进行鉴定，得到具有 免疫保护性高的优势表位。
[0015]进一步，所述的生物信息学法的筛选方法，包括如下步骤：
[0016]步骤1：CV
‑
A10 VP1蛋白二级结构分析：对CV
‑
A10
‑
P148分离株VP1 蛋白序列进行预测，采用DNAStar软件Protein模块中方法预测CV
‑
A10VP1 蛋白的二级结构；
[0017]步骤2：CV
‑
A10 VP1蛋白表位的预测：利用ABCPred、BCPred和 SVMTrip三个在线服务器对CV
‑
A10
‑
P148分离株VP1蛋白进行表位预测， 并结合CV
‑
A10
‑
P148分离株VP1蛋白的二级结构进行表位的筛选，得到5 条符合条件的候选肽段P1、P2、P3、P4及P5，肽段P1、P2、P3、P4及 P5的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5；
[0018]步骤3：通过候选肽段结构定位进一步的筛选：为确定已筛选出的P1、 P2、P3、P4及P5的肽段在柯萨奇病毒A10型颗粒表面的具体位置，构建柯 萨奇病毒A10晶体结构用于进一步筛选，得到暴露于柯萨奇病毒A10晶体 结构的外侧的P3、P4、P5候选肽段；
[0019]步骤4：候选表位疫苗制备及候选肽段的免疫原性测定：分别制备P3、 P4、P5候选肽段的合成肽，并分别与KLH偶联，得到3个偶联肽—候选表 位疫苗，进行动物免疫得到相应的抗血清；再采用间接ELISA法检测候选 肽段特异性抗体水平，验证P3、P4、P5候选肽段均具有免疫原性；
[0020]步骤5：候选表位疫苗体外保护测定：采用微量中和实验对P3、P4、P5 候选肽段基于的表位疫苗抗血清中和抗体滴度进行测定，确认P4肽段为 CV
‑
A10的中和性表位。
[0021]采用上述进一步方案的有益效果是：生物信息学方法筛选通过联合多服 务器参数可提高表位筛选的准确性，但由于预测方法学的不同致使法预测蛋 白质二级结构时存在α
‑
螺旋、β
‑
折叠结构的预测差异，如Chou
‑
Fasman与 Garnier
‑
Rosin法，需通过三级结构进一步筛选；通过将预测出的5条肽段 展示在蛋白五聚体结构上，进一步得到3条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白表位肽，其特征在于，所述表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：6。2.根据权利要求1所述一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白表位肽，其特征在于，所述表位肽为线性中和表位肽。3.基于权利要求1所述一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白表位肽的筛选方法，其特征在于，通过生物信息学法和/或重叠肽法进行互补筛选。4.根据权利要求3所述一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白表位肽的筛选方法，其特征在于，所述的生物信息学法的筛选方法，包括如下步骤：步骤1：CV
‑
A10 VP1蛋白二级结构分析；步骤2：CV
‑
A10 VP1蛋白表位的预测：利用ABCPred、BCPred和SVMTrip三个在线服务器对CV
‑
A10
‑
P148分离株VP1蛋白进行表位预测，并结合CV
‑
A10
‑
P148分离株VP1蛋白的二级结构进行表位的筛选，得到5条符合条件的候选肽段P1、P2、P3、P4及P5，肽段P1、P2、P3、P4及P5的氨基酸序列依次为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5；步骤3：将候选肽段在柯萨奇病毒A10晶体结构在定位，进一步的筛选得到暴露于柯萨奇病毒A10晶体结构的外侧的P3、P4、P5候选肽段；步骤4：候选表位疫苗制备及其免疫原性测定：分别制备P3、P4、P5候选肽段的合成肽，并分别与KLH偶联，得到3个候选表位疫苗，进行动物免疫得到相应的候选表位疫苗抗血清；再采用间接ELISA法检测候选肽段抗血清中候选肽段的特异性抗体水平，验证P3、P4、P5候选肽段均具有免疫原性；步骤5：候选表位疫苗的体外保护测定：采用微量中和实验对基于P3、P4、P5候选肽构建的候选表位疫苗抗血清的中和抗体滴度进行测定，确认基于P4肽构建的表位疫苗具有抗CV
‑
A10保护效果，说明P4肽为CV
‑
A10的中和性表位。5.根据权利要求4所述一种柯萨奇病毒A10型VP1蛋白表位肽的筛选方法，所述的生物信息学法的筛选方法中步骤1的CV
‑
A10 VP1蛋白二级结构分析具体为：对CV
‑
A10
‑
P148分离株VP1蛋白序列进行预测，采用DNAStar软件Protein模块中方法预测CV
‑
A10
‑
P148 VP...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘燕媚，刘洪波，刘启亮，但汉亮，朱寒钰，瞿颖，吴岳，秦颖，雷顺媚，章宁，陈泳蓓，
申请(专利权)人：桂林医学院第二附属医院，
类型：发明
国别省市：