本发明专利技术公开了一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。该羊源嵴病毒VP1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该羊源嵴病毒VP1重组蛋白的制备方法包括：提取羊源嵴病毒核酸后进行扩增后，优化基因序列得到优化核苷酸序列，构建重组原核表达载体、诱导表达及纯化得到。本发明专利技术还提供了一种ELISA检测试剂盒，主要包括包被有羊源嵴病毒VP1重组蛋白的ELISA酶标板。本发明专利技术羊源嵴病毒VP1重组蛋白特异性高，易纯化制备、成本低，可作为抗原能够简便、快速、准确的检测出待测血液样品中的嵴病毒抗体；本发明专利技术ELISA检测试剂盒可以准确测定羊体内抗VP1重组蛋白抗体，可用于疫苗免疫后羊血清抗体的检测以协助判断疫苗的免疫效果。判断疫苗的免疫效果。判断疫苗的免疫效果。
【技术实现步骤摘要】
of Aichi virus with antibody targeting of conserved viral protein 1epitope.Applied microbiology and biotechnology[J],97:8529
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8536.)分析了人爱知病毒VP1抗原表位，表达了一段保守的基序(DNSPQPRTTFDYTDNPLPPDTKL)，制备了抗人爱知病毒VP1的多克隆抗体(Chen et al.,2013)。2013年田野表达了猪嵴病毒VP1原核蛋白，将纯化后的VP1蛋白作为抗原，建立了检测猪嵴病毒抗体的间接ELISA检测方法(田野，猪嵴病毒VP1基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立[M].扬州大学.)，2014年陈蕾表达猪嵴病毒VP1蛋白，利用纯化的重组蛋白建立一种检测猪血清中猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法(陈蕾，四川省猪嵴病毒病流行病学调查及间接ELISA抗体检测方法的建立[M].四川农业大学.2014)。
[0006]鉴于嵴病毒的流行和对畜牧业的危害，建立一种VP1感染和检测方法十分重要。
技术实现思路
[0007]申请人研究团队的实验研究证实，在国内山羊和藏绵羊中存在的KoV是国内致羊腹泻的新发病毒；申请人进一步对四川，云南，重庆山羊腹泻粪便样本和川西北藏绵羊粪便样本进行病原流行病学调查结果显示，其中山羊腹泻粪便样本中KoV的检出率为25.3％，场阳性率为53.3％，藏绵羊粪便样本中KoV的平均检出率为8.7％，场阳性率为66.7％。其中腹泻粪便样本中KoV阳性率(17.5％)，显著高于非腹泻粪便样本中KoV阳性率(0.75％，p<0.001)，上述结果表明该病毒已经在我国羊群中广泛流行且与腹泻密切相关。到目前为止，国内外对羊源KoV相关研究相对较少。
[0008]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。本专利技术首先制备得到羊源嵴病毒VP1重组蛋白，其分子量约为31kDa，能被KoV阳性血清所识别，证明VP1重组蛋白具有生物活性和良好的免疫原性；然后以VP1重组蛋白为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该方法具有良好的重复性、灵敏性、特异性，与羊小反刍兽疫、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒无交叉反应。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0010]本专利技术的第一目的在于提供一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]本专利技术的第二目的在于提供一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0012](4)提取羊源嵴病毒核酸后进行RT
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PCR，拼接扩增序列，对该基因序列进行优化后，得到SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0013](5)在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列两端加酶切位点，N端添加His标签，合成整个核苷酸序列后构建重组原核表达载体；
[0014](6)VP1重组蛋白的诱导表达及纯化。
[0015]在构建表达载体时，目的基因通常由临床样本或实验室培养物中直接扩增后克隆转化，扩增受样本处理方式和核酸浓度影响大同时需要一对可完全扩增目的基因的引物，本专利技术在已知基因序列的情况下，利用生物软件对基因序列进行了大肠杆菌偏爱密码子优化，将改造后的序列全序列合成，无需单独设计完全扩增目的基因的引物，避免了直接从临
床样本或实验室培养物中扩增的对实验进程的影响，同时也便于对序列进行表达系统相应偏爱密码子优化和改造，有利于提高重组蛋白在表达系统中的产量和表达效率。
[0016]相比真核表达系统，本专利技术采用原核表达系统成本更低，原核表达使用的试剂材料容易获得，且无需特殊仪器，便于操作，同时生产周期短，可在几天时间内合成大量优良的重组蛋白，易于形成产业化的规模，适合推广使用；抗原蛋白通过原核表达系统表达成包涵体，包涵体在变性条件下纯化，然后复性再折叠，再经过自我组装等过程而有效制备，弥补了原核表达系统缺少像真核系统重组蛋白表达后的修饰能力、不能产生正确的二硫键的缺点，同时缩短了重组蛋白的表达时间、提高了重组蛋白的生产效率。
[0017]进一步地，所述羊源嵴病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0018]进一步地，在如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的5
’
端增加酶切位点Nde I，3
’
端增加酶切位点Xho I。
[0019]本专利技术的第三目的在于提供一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白表达载体，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0020]本专利技术的第四目的在于提供一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白表达工程菌，所述工程菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0021]本专利技术的第五目的在于提供一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白的抗体的ELISA检测试剂盒，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0022]进一步地，所述的ELISA检测试剂盒包括：
[0023](A)包被有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羊源嵴病毒VP1重组蛋白的ELISA酶标板；
[0024][0025](B)标准阴性血清：羊源嵴病毒核酸检测为阴性的血清；
[0026](C)标准阳性血清：羊源嵴病毒阳性血清；
[0027](D)酶标二抗：HRP标记的兔抗羊IgG；
[0028](E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。
[0029]通常间接法ELISA首先用抗原包被固相载体，然后加入特异性抗体即一抗，使之与固相抗原结合，再加入酶标记的二抗，使之与一抗结合，反应后加入底物显色，颜色的深浅与标本中抗原的量成正比，可通过酶标仪显示具体数据。由于这一过程有多次洗板操作，难免引起误差，造成标本假低值，甚至出现假阴性的错误结果，且较耗费时间。对此，专利技术人研究发现，对ELISA检测过程中的试剂(包被液、稀释液、显色液、终止液)及浓度、孵育条件(温度、时间等)进行优化可进一步提高检测结果的准确率。
[0030]进一步地，所述(A)中重组蛋白的包被浓度为0.6～0.9μg/mL，优选为0.75μg/mL；
[0031]所述(E)中样品稀释液、包被液均为磷酸盐缓冲液，浓度为40～60mM，pH值为7.2～8，优选浓度为50mM，pH值为7.6；
[0032]ELISA酶标板洗涤液为PBST；
[0033]抗体稀释液为1％牛血清白蛋白；
[0034]封闭液为3.5～4.5％PEG6000+PBS，优选为4％PEG6000+PBS；
[0035]显色液为TMB，终止液为1～3mol/L H2SO4。
[0036]本专利技术的第六目的在于提供一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白的抗体的ELISA检测方法，包括以下本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述羊源嵴病毒VP1重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取羊源嵴病毒核酸后进行RT
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PCR，拼接扩增序列，对该基因序列进行优化后，得到SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；(2)在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列两端加酶切位点，N端添加His标签，合成整个核苷酸序列后构建重组原核表达载体；(3)VP1重组蛋白的诱导表达及纯化。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述羊源嵴病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的5
’
端增加酶切位点Nde I，3
’
端增加酶切位点Xho I。5.一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白表达载体，其特征在于，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白表达工程菌，其特征在于，所述工程菌包括权利要求5所述的核苷酸序列。7.一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白的抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的氨基酸序列。8.如权利要求7所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒包括：(A)包被有权利要求1所述的羊源嵴病毒VP1重组蛋白的ELISA酶标板；(B)标准阴性血清：羊源嵴病毒核酸检测为阴性的血清；(C)标准阳性血清：羊源嵴病毒阳性血清；(D)酶标二抗：HRP标记的兔抗羊IgG；(E)样品稀释液、包被液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤承，岳华，王远微，阿比克哈莫，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：
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