一种VP1蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种VP1蛋白及其制备方法和应用。一种VP1蛋白的制备方法，将诱导表达的VP1包涵体蛋白经过洗涤、尿素溶解、变性纯化、复性得到VP1蛋白；其中，所述的复性采用涡流复性装置进行涡流复性。本发明专利技术选择了大肠杆菌表达的不带有任何多余序列的VP1蛋白作为抗原，用涡流装置对表达的蛋白进行了复性，蛋白在涡流复性装置中均一剪切力的作用下构象变的规则，使其更加接近于天然的蛋白，得到的抗原蛋白相关检测指标都符合人用疫苗标准，复性的蛋白和铝佐剂混合免疫小鼠后在体内产生了很好的免疫原性反应，得到的血清具有较高的中和效价，这为EV71或CA16亚单位疫苗的研制奠定了基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
一种VP1蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，涉及一种VP1蛋白及其制备方法和应用。
技术背景
[0002]手足口病是以发热和受手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡和疱疹性咽炎为主要特征的一种常见小儿疾病，少数患者还可引起心肌炎、肺水肿以及脑炎等致命性并发症，多发生于5岁以下的婴幼儿。引起手足口病的病原体主要是肠道病毒71型(EV71)以及柯萨奇病毒A16型 (CA16)。
[0003]研究表明，EV71及CA16主要与重症手足口病相关，它具有嗜神经毒性并且进一步引起无菌性脑炎、脑膜脑炎和心肌炎等并发症，严重者可能致残或者致死。EV71及CA16于1969年首次从加利福尼亚的中枢神经系统疾病患者粪便标本中分离以来，在世界范围内多次发生过EV71及 CA16感染的手足口病流行，近几十年在中国、马来西亚、越南国家以及中国台湾地区频繁爆发了高死亡的EV71及CA16感染，严重危害了公共健康安全。
[0004]EV71及CA16属于小核糖核酸病毒，其基因组是由7408个核苷酸的单股正链RNA构成，编码一个2194个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白可被进一步水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，P1 前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP4四个结构蛋白，这四个蛋白共同组成了病毒的离子外壳，其中VP1直接决定了病毒的抗原性，并且具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，因此在EV71 及CA16的基因组以及疫苗研制中广受重视。
[0005]目前针对EV71及CA16还没有特效药物，因此疫苗的研制就迫在眉睫。由于对EV71及CA16的病原学、感染机制、致病机制及流行病学等基础性研究做的还不够，EV71及CA16病毒株在流行过程中容易发生变异，而且没有很好的动物模型，这就大大增加了疫苗研发的难度。目前EV71 及CA16的疫苗主要有灭活疫苗、减毒活疫苗、类病毒颗粒疫苗、亚单位疫苗、转基因口服疫苗以及合成肽疫苗，虽然灭活病毒疫苗已经处于临床Ⅲ试验阶段，但其在安全性上还有待验证，其它的这些疫苗都处在研发以及临床尝试阶段，真正上市的产品还没有看到,这就需要我们更大力度的投入到疫苗研制的队伍中来。
[0006]EV71及CA16的亚单位疫苗主要以VP1作为首选靶标，相关研究表明能产生较好的中和性抗体的抗原主要是昆虫细胞表达纯化得到的VP1蛋白，而大肠杆菌表达的VP1蛋白作为抗原的普遍中和性抗体效价较低，主要原因还是大肠杆菌中表达的蛋白在折叠和加工方面较差，但是大肠杆菌表达的VP1的蛋白具有表达效率高，生产成本低以及易于大规模生产的特点，而且从大肠杆菌中得到的蛋白作为疫苗具有较高的安全性，易于被人们接受，因此从大肠杆菌表达获得的亚单位疫苗研究也变得越来越受青睐。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有EV71及CA16亚单位疫苗产生的中和保护性抗体效价低的缺陷，提供一种用涡流装置复性的EV71或CA16亚单位疫苗制备方法，用EV71或CA16的VP1蛋白为抗原，在涡流装置中进行复性，复性后的蛋白和铝佐剂混合免疫小鼠产生特异的
中和性抗体。
[0008]为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种VP1蛋白的制备方法，将诱导表达的VP1包涵体蛋白经过洗涤、尿素溶解、变性纯化、复性得到VP1蛋白；其中，所述的复性采用涡流复性装置进行涡流复性；所述的VP1蛋白选自EV71或CA16的VP1蛋白。
[0010]本专利技术提供的EV71的VP1序列是经公司全基因合成优化的，核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；本专利技术提供的CA1671的VP1序列是经公司全基因合成优化的，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；把得到的VP1 核苷酸序列克隆入pET22b表达载体构建成pET22b
‑
VP1重组表达载体，将质粒导入大肠杆菌 BL21trxB(DE3)进行诱导表达，得到的菌液经过超声离心获得VP1包涵体蛋白。
[0011]作为本专利技术的一种优选，所述的制备方法，涡流复性装置的玻璃管内径是1cm，玻璃管长 16cm，装液量为1mL，复性玻璃管角度在30
°‑
80
°
，转速在3000
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8000rpm，复性时间为 10
‑
30min。
[0012]作为本专利技术的一种优选，所述的制备方法，所述的洗涤是将得到的VP1包涵体蛋白依次用洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2和洗涤缓冲液3洗涤，最后用超纯水润洗，最后得到的蛋白为洗涤后的包涵体蛋白；其中，
[0013]所述的洗涤缓冲液1配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，0.15mol/LNaCl，2mol/L尿素， 1％TritonX
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100，5mmol/L EDTA，
[0014]所述的洗涤缓冲液2配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，0.15mol/LNaCl，4mol/L尿素， 1％TritonX
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100，5mmol/L EDTA；
[0015]所述的洗涤缓冲液3配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，0.15mol/LNaCl，2mol/L尿素，1％TritonX
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100，5mmol/L EDTA，2％脱氧胆酸钠。
[0016]作为本专利技术的一种优选，所述的制备方法，所述的尿素溶解是将洗涤后的包涵体蛋白用高浓度尿素溶液溶解，离心收获上清即为尿素溶解后的包涵体蛋白，所述的高浓度尿素溶液配方为20mmol/L Tris
‑
HCl pH8.0，8mol/L尿素，70mmol/Lβ
‑
巯基乙醇。
[0017]作为本专利技术的一种优选，所述的制备方法，所述的变性纯化是将包涵体蛋白依次经强阴离子交换纯化和Sepharose CL
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4B凝胶过滤层析纯化。
[0018]作为本专利技术的一种优选，所述的制备方法，所述的强阴离子交换纯化为使用预先装好经过酸碱漂洗的强阴离子交换柱填料对包涵体溶解后的蛋白进行强阴离子交换纯化；优选先用超纯水冲洗柱子，再用平衡缓冲液，直到基线平衡为止，将VP1蛋白样品缓慢上样，再次用平衡缓冲液冲洗柱子，直到基线平衡为止，将平衡后的样品用洗脱缓冲液洗脱，纯化后得到的目的蛋白；所述的平衡缓冲液配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，8mol/L尿素，70mmol/Lβ
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巯基乙醇；洗脱缓冲液配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，8mol/L尿素，70mmol/Lβ
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巯基乙醇， 80mmol/LnaCl；所述的Sepharose CL
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4B凝胶过滤层析的方法为对经强阴离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种VP1蛋白的制备方法，其特征在于，将诱导表达的VP1包涵体蛋白经过洗涤、尿素溶解、变性纯化、复性得到VP1蛋白；其中，所述的复性采用涡流复性装置进行涡流复性；所述的VP1蛋白选自EV71或CA16的VP1蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，涡流复性装置的玻璃管内径是1cm，玻璃管长16cm，复性玻璃管角度在30
°‑
80
°
，转速在3000
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8000rpm，复性时间为10
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30min。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的洗涤是将得到的VP1包涵体蛋白依次用洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2和洗涤缓冲液3洗涤，最后用超纯水润洗，最后得到的蛋白为洗涤后的包涵体蛋白；其中，所述的洗涤缓冲液1配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，0.15mol/LNaCl，2mol/L尿素，1％TritonX
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100，5mmol/L EDTA，所述的洗涤缓冲液2配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，0.15mol/LNaCl，4mol/L尿素，1％TritonX
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100，5mmol/L EDTA；所述的洗涤缓冲液3配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，0.15mol/LNaCl，2mol/L尿素，1％TritonX
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100，5mmol/L EDTA，2％脱氧胆酸钠。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的尿素溶解是将洗涤后的包涵体蛋白用高浓度尿素溶液溶解，离心收获上清即为尿素溶解后的包涵体蛋白，所述的高浓度尿素溶液配方为20mmol/L Tris
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HCl pH8.0，8mol/L尿素，70mmol/Lβ
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巯基乙醇。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的变性纯化是将包涵体蛋白依次经强阴离子交换纯化和Sepharose CL
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4B凝胶过滤层析纯化。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的强阴离子交换纯化为使用预先...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴洪流，胡广，张明，郭蕾，陈国，
申请(专利权)人：北京凯悦宁医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：