用于抑制人肠道71型病毒的卵黄抗体、制备方法于应用技术

本发明专利技术公开一种用于抑制人肠道71型病毒的卵黄抗体、制备方法于应用，其中抗原为含有EV71病毒VP1抗原，其为将VP1蛋白对应的核苷酸序列经优化后，克隆到pET28a，pET30或pColdII原核表达载体内，经原核表达菌BL21，Rosetta或OrigamiB表达得到的含有EV71病毒VP1抗原，将该抗原免疫产蛋母鸡得到含卵黄抗体鸡蛋，经过提纯得到含有抗EV71的卵黄抗体，该抗EV71卵黄抗体IgY具有较强的中和EV71的活性，能够阻断EV71的感染，能够有效阻断EV71的传染，进而预防EV71引发的手足口疾病。防EV71引发的手足口疾病。

【技术实现步骤摘要】
IgY在4℃存放5年，置室温6个月，抗体活性没有降低。在用pH4以上的胃蛋白酶处理，有60％左右的IgY仍保留抗原结合活性，表明IgY对胃蛋白酶具有很好的抵抗力。反复冻融对哺乳动物类抗体的抗原结合活性有较大的影响，但IgY在经过5次冻融后抗体活性几乎不受影响。
[0007]由于禽类和人亲缘关系较远，种系差别大，使得IgY在检测诊断上具有稳定性、特异性和灵敏度高、免疫干扰小、背景低等优点。已经证明，口服特异性IgY抗体对包括牛和人轮状病毒、肠毒性大肠杆菌、牛冠状病毒、沙门菌属、葡萄球菌、假单胞菌等多种肠道菌具有抵抗作用。另外IgY已成功应用于口腔疾病、咽喉炎、流感、鼻炎和鼻窦炎、妇科感染、胃炎、艾滋病等粘膜性疾病防治。
[0008]目前手足口病的治疗方法有痰热清注射液、热宁、延胡宁、阿昔洛韦、利巴韦林、干扰素、西洋平等，这些方法虽然能够部分缓解疾病的症状，但是没有特异抑制 EV71，阻断EV71引起的疾病，同时控制其传染。

技术实现思路

[0009]专利技术目的：针对目前EV71的致病性和传染性，本申请利用目前EV71病毒的蛋白 VP1保守序列获得抗原制备蛋黄球蛋白，改进免疫方案和纯化方法提高卵黄抗体的得率和纯度，获得一种能够抗EV71的卵黄抗体，该IgY具有较强的中和EV71的活性，能够阻断EV71的感染，能够有效阻断EV71的传染。
[0010]本专利技术目的在于针对现有技术的不足，提供一种含有EV71病毒VP1抗原的制备的方法。
[0011]本专利技术另一目的在于提供采用上述抗原免疫的得到的用于抑制人肠道EV71的卵黄抗体的制备方法。
[0012]本专利技术的第三目的在于提供采用上述方法制备的抑制人肠道EV71的卵黄抗体。
[0013]本专利技术第四目的在于提供上述抑制人肠道EV71的卵黄抗体在制备复合卵黄抗体产品、食品、食品添加剂、保健食品、药品、化妆品、消毒用品、日用品中的应用。
[0014]本专利技术第四目的在于提供上述抑制人肠道EV71的卵黄抗体在诊断手足口病中的应用。
[0015]技术方案：本专利技术所述一种含有EV71病毒VP1抗原，其为将VP1蛋白对应的核苷酸序列经优化后，克隆到pET28a，pET30或pColdII原核表达载体内，经原核表达菌 BL21，Rosetta或OrigamiB表达得到的含有EV71病毒VP1抗原；
[0016]其中VP1蛋白对应的核苷酸序列L1为：
[0017]ggcgaccgtgtggcggatgttatcgaaagcagcattggtgacagcgtgagccgtgcgctgacccatgcgctgccggcgccgaccggccagaac acccaagtgagcagccaccgtctggacaccggcaaggttccggcgctgcaagcggcggagattggtgcgagcagcaacgcgagcgatgagagcatg attgaaacccgttgcgtgctgaacagccacagcaccgcggaaaccaccctggacagcttctttagccgtgcgggtctggttggcgagatcgatctgccgct gaagggtaccaccaacccgaacggctacgcgaactgggacatcgatattaccggttatgcgcaaatgcgtcgtaaagtggaactgttcacctacatgcgtt ttgatgcggagttcacctttgttgcgtgcaccccgaccggcgaagtggttccgcagctgctgcaatatatgttcgtgccgccgggtgcgccgaaaccggat agccgtgaaagcctggcgtggcagaccgcgaccaacccgagcgtgttcgttaaactgagcgatccgccggcgcaagtgagcgttccgtttatgagcccg gcg
agcgcgtaccaatggttctacgacggttatccgacctttggcgagcacaagcaagaaaaagatctggagtatggtgcgtgcccgaacaacatgatgg gcaccttcagcgtgcgtaccgttggtaccagcaagagcaaatacccgctggttgtgcgtatctatatgcgtatgaaacacgttcgtgcgtggattccgcgtcc gatgcgtaaccagaactacctgtttaaggcgaacccgaactatgcgggtaacagcatcaaaccgaccggtgcgagccgtaccgcgattaccaccctgtaa ；
[0018]含有EV71病毒VP1抗原的蛋白序列为L2：
[0019]GDRVADVIESSIGDSVSRALTHALPAPTGQNTQVSSHRLDTGKVPALQAAEIGASSNASDESMI ETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLKGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMR FDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPDSRESLAWQTATNPSVFVKLSDPPAQVSVPFMS PASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGTSKSKYPLVVRIYMRMKHVR AWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGASRTAITTL。
[0020]进一步地，所述核苷酸序列优化的具体方法为：根据表达宿主大肠杆菌密码子使用的偏爱性优化需要表达的核酸序列，优化后的核酸序列克隆到所述原核表达菌载体内；蛋白表达后需要纯化，选择四种不同的蛋白标签克隆到核酸序列的3
’
端，蛋白标签的核酸序列如下：
[0021]6×
His：CATCACCATCACCATCAC；
[0022]Myc：GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG；
[0023]HA:TACCCATACGATGTT CCAGATTACGCT；
[0024]Flag：GACTACAAAGACGATGACGACAAG。
[0025]本专利技术还提供了上述含有EV71病毒VP1抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0026](11)原核细菌培养：将原核表达细菌BL21，Rosetta或OrigamiB划线接种到LB 培养板上，放30～40℃培养箱过夜，第二天，挑取单菌落于LB培养基内，30～40℃， 200～350rpm摇床过夜培养；第三天，将过夜培养的菌液按1:50～100接种到新鲜的LB 培养基内，30～40℃，3000～4000rpm培养1-2h至OD600至0.5～0.7，将细菌培养液转入离心管内，冰上放置10分钟，4℃3000～4000rpm离心10分钟；弃上清，用预冷的0.05M 的CaCl2溶液轻轻重悬细胞，冰上放置30分钟，4℃4000rpm离心10分钟；弃上清，加入预冷的含15％甘油的0.05M的CaCl2溶液，重悬细胞，冰上放置后，每管本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有EV71病毒VP1抗原，其特征在于：其为将VP1蛋白对应的核苷酸序列经优化后，克隆到pET28a，pET30或pColdII原核表达载体内，经原核表达菌BL21，Rosetta或OrigamiB表达得到的含有EV71病毒VP1抗原；其中VP1蛋白对应的核苷酸序列L1为：ggcgaccgtgtggcggatgttatcgaaagcagcattggtgacagcgtgagccgtgcgctgacccatgcgctgccggcgccgaccggccagaacacccaagtgagcagccaccgtctggacaccggcaaggttccggcgctgcaagcggcggagattggtgcgagcagcaacgcgagcgatgagagcatgattgaaacccgttgcgtgctgaacagccacagcaccgcggaaaccaccctggacagcttctttagccgtgcgggtctggttggcgagatcgatctgccgctgaagggtaccaccaacccgaacggctacgcgaactgggacatcgatattaccggttatgcgcaaatgcgtcgtaaagtggaactgttcacctacatgcgttttgatgcggagttcacctttgttgcgtgcaccccgaccggcgaagtggttccgcagctgctgcaatatatgttcgtgccgccgggtgcgccgaaaccggatagccgtgaaagcctggcgtggcagaccgcgaccaacccgagcgtgttcgttaaactgagcgatccgccggcgcaagtgagcgttccgtttatgagcccggcgagcgcgtaccaatggttctacgacggttatccgacctttggcgagcacaagcaagaaaaagatctggagtatggtgcgtgcccgaacaacatgatgggcaccttcagcgtgcgtaccgttggtaccagcaagagcaaatacccgctggttgtgcgtatctatatgcgtatgaaacacgttcgtgcgtggattccgcgtccgatgcgtaaccagaactacctgtttaaggcgaacccgaactatgcgggtaacagcatcaaaccgaccggtgcgagccgtaccgcgattaccaccctgtaa；含有EV71病毒VP1抗原的蛋白序列为L2：GDRVADVIESSIGDSVSRALTHALPAPTGQNTQVSSHRLDTGKVPALQAAEIGASSNASDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLKGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPDSRESLAWQTATNPSVFVKLSDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGTSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGASRTAITTL。2.根据权利要求1所述的含有EV71病毒VP1抗原，其特征在于：所述核苷酸序列优化的具体方法为：根据表达宿主大肠杆菌密码子使用的偏爱性优化需要表达的核酸序列，优化后的核酸序列克隆到所述原核表达菌载体内；蛋白表达后需要纯化，选择四种不同的蛋白标签克隆到核酸序列的3
’
端，蛋白标签的核酸序列如下：6
×
His：CATCACCATCACCATCAC；Myc：GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG；HA:TACCCATACGATGTT CCAGATTACGCT；Flag：GACTACAAAGACGATGACGACAAG。3.一种权利要求1所述含有EV71病毒VP1抗原的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(11)原核细菌培养：将原核表达细菌BL21，Rosetta或OrigamiB划线接种到...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀芳，杨昌顺，
申请(专利权)人：南京蛋球球生物医学技术合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：