(22R,23R)-22,23-双羟基-7-脱氢菜油甾醇及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种(22R,23R)

【技术实现步骤摘要】
(22R,23R)
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22,23
‑
双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇及其制备方法，本专利技术在真菌中，通过基因编辑，获得了产(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇的重组真菌菌株，涉及合成生物学
以及酶工程领域。

技术介绍

[0002]芸苔素甾类化合物(Brassinosteroids，BRs)是第六类植物激素，在种子萌发、根系生长、繁殖等植物生长过程中起着至关重要的作用。此外，它们还能够与其他植物激素相协调，调节植物氧化自由基的代谢、乙烯合成和根向重力反应，提高植物对如干旱、高盐、极端温度等苛刻环境的抗逆性。作为BRs中生物活性最高的化合物，芸苔素内酯(Brassinolide，BL，又称油菜素内酯)(图1)具有巨大的应用潜力。然而，由于BL在植物中含量极低，且缺乏可以规模供应的前体物质，因此一直无法量产。迄今为止，有两种BRs已经在农业得到广泛的应用，即24
‑
表芸苔素内酯(24
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Epi
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brassinolide，EBL)和28
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高芸苔素内酯(28
‑
Homo
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brassinolide，HBL)(图1)，其半合成的前体分别是麦角甾醇(T.C.Mcmorris,et al,J Org Chem,1993(58),2338)(图2)和豆甾醇(T.C.Mcmorris,et al,Phytochemistry,1994(36),585)。申请人此前通过比较BL与EBL的侧链结构，根据逆合成分析，提出24
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表
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麦角甾醇可以作为BL半合成的前体，并构建重组酿酒酵母实现了24
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表
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麦角甾醇的规模化制备，为BL的工业生产奠定了基础(专利申请号：CN2022115062236；Y.Jiang,et al,Nat Commun,2023(14),437)。
[0003]在BL及其类似物的半合成反应过程中，最为关键的一步是稀有铂族金属(如锇和钌)氧化物催化的双键双羟基化反应(如OsO4催化的Sharpless不对称双羟基化反应，图3)。研究发现，在24
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epi
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BL和28
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homo
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BL的化学合成中，采用铂族金属氧化物催化，A环上Δ2的双羟基化通常只会形成2α,3α
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双羟基，而侧链Δ
22
会形成两种构型：22R,23R
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双羟基和22S,23S
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双羟基，两种构型间的比例主要取决于催化剂类型、底物C
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24的立体结构以及手性配体的种类，其中OsO4催化的Sharpless不对称双羟基化反应能够更高效地获得22R,23R
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双羟基产物(J.A.R.Salvador,et al,Curr Org Chem,2008(12):492
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522)。在农业应用上，相较于具有22R,23R
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双羟基的BRs，具有22S,23S
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双羟基的BRs的生物活性明显下降，甚至完全丧失生物活性(S.L.Acebedo,et al,Steroids,2009(74),435
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440)。为了高收率地获得具有22R,23R
‑
双羟基结构的BRs(如BL)，在化学合成过程中，需要使用剧毒的OsO4和昂贵的手性配体，成本高、危险性大，限制了高活性BRs的商业应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种结构式(I)所示的化合物(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇及其制备方法。
[0005]本专利技术为达到上述目的所采用的技术方案是：
[0006]本专利技术首先提供了一种结构式(I)所示的化合物(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱
氢菜油甾醇(((22R,23R)
‑
22,23
‑
diOH
‑
Δ7‑
campesterol))：
[0007][0008]本专利技术进一步提供了一种合成(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇的真菌的构建方法，将植物来源的C
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22甾醇羟化酶、C
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23甾醇羟化酶和细胞色素P450还原酶基因重组表达到产24
‑
表
‑
麦角甾醇的真菌细胞内，构建得到合成(22R,23R)
‑
22,23
‑
双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇的菌株。
[0009]作为本专利技术的优选方案，所述产24
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表
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麦角甾醇的真菌是产麦角甾醇的真核微生物或其ERG5基因敲除的突变体，优选的是酵母科(Saccharomycetaceae)、菌核菌科(Sclerotiniaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、肉座菌科(Hypocreaceae)、发菌科(Trichocomaceae)、曲霉菌科(Aspergillaceae)、白蘑科(Tricholomataceae)真核微生物或上述真核微生物的ERG5基因敲除的突变体，特别优选的是敲除ERG5基因的酿酒酵母。
[0010]进一步的，所述的C
‑
22甾醇羟化酶、C
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23甾醇羟化酶和细胞色素P450还原酶基因来源于产芸苔素内酯类化合物的植物，优选为来源于唇形科、十字花科桑科植物，优选的是芸苔素内酯类化合物含量较高的植物。
[0011]进一步的，所述C
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22甾醇羟化酶基因为编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因；所述C
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23甾醇羟化酶基因为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基因；所述细胞色素P450还原酶基因为编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的基因。
[0012]进一步的，所述植物来源C
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22甾醇羟化酶、C
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23甾醇羟化酶和细胞色素P450还原酶基因，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana，At)。
[0013]进一步的，所述产24
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表
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麦角甾醇的真菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇，其特征在于其结构式如式(I)所示：2.权利要求1所述的(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇在制备芸苔素甾类化合物中的应用。3.一种合成权利要求1所述(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇的真菌的构建方法，其特征在于，将植物来源的C
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22甾醇羟化酶基因、C
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23甾醇羟化酶基因和细胞色素P450还原酶基因重组表达到产24
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表
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麦角甾醇的真菌细胞内，构建得到合成(22R,23R)
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22,23
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双羟基
‑7‑
脱氢菜油甾醇的真菌菌株。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述产24
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表
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麦角甾醇的真菌是产24
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表
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麦角甾醇的真核微生物或其敲除了ERG5基因的突变体，优选的是酵母科(Saccharomycetaceae)、菌核菌科(Sclerotiniaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、肉座菌科(Hypocreaceae)、发菌科(Trichocomaceae)、曲霉菌科(Aspergillaceae)、白蘑科(T...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建平，蒋亦琪，朱力，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：