与PEDVNsp5蛋白结合的抑制性多肽制造技术

本发明专利技术借助于机器学习模型，针对PEDV Nsp5蛋白晶体结构的解析，通过多肽虚拟筛选技术，筛选到与靶标蛋白具备潜，其多肽序列为YKKLHK(162860)人工固相合成162860序列，并利用人工表达的PEDV Nsp5蛋白，借助ELISA实验对多肽进行筛选；借助表面等离子共振实验（SPR）鉴定多肽与靶蛋白的亲和力常数；通过CCK

【技术实现步骤摘要】
与PEDV Nsp5蛋白结合的抑制性多肽


[0001]本专利技术涉及与猪病毒性腹泻病毒Nsp5蛋白特异性结合的多肽序列及其应用，属于多肽设计、病毒抑制、药物筛选开发领域。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(PED)在20世纪70年代初首次在欧洲发现，1978年在比利时首次分离到该病毒。据报道，PEDV已经在许多猪的生产地区爆发，包括中国、美国、加拿大和欧洲，它引起严重的肠道疾病，给全世界的养猪业带来了巨大的经济损失。它编码四个主要的结构蛋白：穗状体(S)、核衣壳(N)、膜(M)和包膜(E)。其中非结构蛋白Nsp5被称为3C样蛋白酶(3Cpro)，主要参与冠状病毒蛋白的切割，与病毒各个阶段的复制有关并在病毒的生活周期中发挥作用。因此，Nsp5是冠状病毒抗病毒药物的重要靶标蛋白。然而，现有的PED疫苗不能对流行的PEDV感染提供适当的保护。考虑到这一因素，针对新的PEDV菌株或靶向位点的研究对于预防和控制新出现或重新出现的传染病是必要的。
[0003]猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因组的三分之二(ORF1a和1b)编码一个大的复制酶多聚蛋白，而基因组的其余部分则编码结构蛋白和附属蛋白。PEDV病毒进入宿主细胞后，ORF1a编码大的多聚蛋白1a(pp1a)，而ORF1b通过核糖体变框表达为pp1ab融合蛋白。通过Nsp3和Nsp5的蛋白酶活性，这些多聚蛋白被蛋白酶加工成16种非结构蛋白(Nsp1至16)，介导病毒RNA基因组的复制和一组嵌套的亚基因组mRNA的合成。PEDV Nsp5的半胱氨酸蛋白酶活性有助于NEMO的蛋白分解，是一种IFN拮抗剂，编码谷氨酰胺231(Q231)的3C类蛋白酶，对病毒和宿主之间的战略互动产生根本性影响，这对PEDV感染的机制是决定性因素。因此，靶向Nsp5的多肽设计，将为PEDV的防治提供新的途径。
[0004]肽的结构相对简单，分子量小，因此易于合成和修饰，具有较高的细胞膜穿透性，无细胞毒性，免疫原性小。筛选多肽的常用方法有噬菌体展示技术、mRNA展示技术、组合化学技术、基于计算机的虚拟筛选技术等。然而，这些方法高度依赖高通量的实验筛选，容易增加工作量。而基于结构的分子对接技术可以克服这个问题。分子对接是计算虚拟筛选的关键技术之一，它试图预测配体与蛋白质活性部位的结合方式和亲和力。它具有很多优点，如操作简单、快速，减少了多肽筛选的工作量，缩短了开发周期，提高了筛选成功率等。

技术实现思路

[0005]本专利技术借助于机器学习模型，针对PEDV Nsp5蛋白晶体结构的解析，通过多肽虚拟筛选技术，筛选到与靶标蛋白具备潜，其多肽序列为YKKLHK(162860)人工固相合成162860序列，并利用人工表达的PEDV Nsp5蛋白，借助ELISA实验对多肽进行筛选；借助表面等离子共振实验(SPR)鉴定多肽与靶蛋白的亲和力常数；通过CCK
‑
8试剂盒检验多肽162860对细胞毒性；借助荧光定量PCR和间接免疫荧光实验试验其抑制病毒感染的活性，结果表明162860序列可显著抑制PEDV的感染。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]与猪病毒性腹泻病毒Nsp5蛋白特异性结合的多肽序列，所述的多肽序列为YKKLHK。
[0008]所述的多肽序列，其特征在于，包括以上所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的修饰和以此为基础的改造；修饰材料包括但不限制在纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质上；改造材料包括但不限制在天然氨基酸、非天然氨基酸。
[0009]所述的多肽序列在针对猪病毒性腹泻病毒检测和抑制猪病毒性腹泻病毒领域的应用。
[0010]本专利技术的有益效果：
[0011]1、本专利技术基于PEDV Nsp5蛋白晶体结构，通过分子对接虚拟筛选技术和机器学习模型，获得一条与PEDV Nsp5特异性结合的多肽序列162860，其多肽序列为YKKLHK。通过表面等离子共振检测，多肽与PEDV Nsp5蛋白的平衡解离常数K
D
为5.676
×
10
‑6M，即5.68μM，说明具备较高的亲和力。
[0012]2、本专利技术设计多肽在细胞水平进行病毒抑制实验，其有效抑制病毒复制的多肽浓度达3.125μM，病毒抑制效果出众。
附图说明
[0013]图1为162860序列与PEDV Nsp5蛋白的对接结果展示。
[0014]图2为162860序列与PEDV Nsp5蛋白的SPR亲和力鉴定结果。图中，曲线自上至下依次为25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM，1.5625μM。其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。
[0015]图3为162860与人工表达PEDV Nsp5蛋白的ELISA鉴定结果。
[0016]图4为162860对Vero细胞毒性的鉴定结果。
[0017]图5 162860抑制PEDV感染Vero细胞的qRT
‑
PCR鉴定结果。
[0018]图6 162860抑制PEDV感染Vero细胞的间接免疫荧光鉴定结果。
具体实施方式
[0019]以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0020]实施例1分子对接及虚拟肽库的筛选
[0021]在蛋白质结构库中下载PEDV Nsp5结构数据(PDB ID:4XFQ)，删除水分子和其它无关分子，并对侧链完整性进行评估，补充完整侧链基团，并将整个蛋白质结构能量最小化。借助计算机虚拟生成的肽库，与蛋白质结构进行虚拟对接，并计算分子间相互作用的力学参数。以已测定的多肽与蛋白质亲和力常数和相互作用力学为训练集，采用随机森林机器学习方法，建立评估多肽亲和力预测模型。通过预测结果的好坏来进行多肽优劣的筛选，以评估值为最佳(E评分)的多肽为候选多肽，进行下一步多肽合成和功能验证。多肽与蛋白相互作用模型预测结果(见图1)。
[0022]实施例2 162860与人工表达Nsp5蛋白的亲和力鉴定(SPR)
[0023]1、在把蛋白固定到芯片上之前，需要筛选合适的缓冲液pH，使配体通过静电吸附作用富集到芯片表面附近，达到较好的偶联效果。使用pH 5.5、5.0、4.5、4.0的醋酸钠溶液稀释PEDV Nsp5样品为40μg/mL。上样时间180s，50mM的NaOH作为清洗溶液，根据结果确定使
用pH5.0作为偶联条件。
[0024]2、使用直接偶联法固定PEDV Nsp5至CM5芯片表面。选择通道，将Flow Cell 1作为参照通道，Flow cell 2作为样品通道。选择偶联方法为氨基偶联Amine。选择偶联方式为Specify contact time:以固定的接触时间为偶联标准。点击next，选load sample，取出样品盘，按照表格中的示意图，一一对应放入所需试剂。将样品盘放回托架，点击next；检查缓冲液等，保存方法和结果文本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与猪病毒性腹泻病毒Nsp5蛋白特异性结合的多肽序列，其特征在于，所述的多肽序列为YKKLHK。2.根据权利要求1所述的多肽序列，其特征在于，包括以上所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的修饰和以此为基础的改造；修饰材料包括但不限制...

【专利技术属性】
技术研发人员：王方雨，张改平，孙雪峰，焦文强，郭军庆，冯华，徐倩，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：