一种糖类物质生物芯片标记和检测方法技术

本发明专利技术提供了一种糖类物质生物芯片标记和检测方法。该方法以多肽修饰的金纳米粒子作为糖类物质生物芯片的标记物；以共振光散射光谱法为糖类物质生物芯片的检测手段；通过亲和素与生物素反应标记反应过程。该方法具有通用性，并具有灵敏度高，达到３２ｎｇ／ｍＬ；选择性好以及样品消耗量少的特点。该方法获得的单糖检测限为：８μＭ，凝集素检测限为１００ｐｇ／ｍＬ；二者的线性范围均为：３个数量级；得的糖蛋白检测限为：３２ｎｇ／ｍｌ，凝集素检测限为２５．６ｐｇ／ｍＬ；二者的线性范围均为：３个数量级。该方法可实现对单糖，糖蛋白检测以及糖类物质与相应凝集素之间相互作用的研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
由于无机纳米粒子(金,银，量子点等)具有特殊的物理和化学性质，近 十年来被广泛应用于各种纳米技术，生物纳米技术和生物医学检测技术等领域(化学综述，Cta Jev.， 2004，族，293-346; Oz缀to， 2005,風 1547-1562)。共振光散射技术(RLS)是近年迅速发展起来的新的仪器分析 技术，因其灵敏度高，操作简单等显著特点而备受关注(科学，化^2w, 1995, 2眠935-939;科学，Scz'e"ce, 2000, 2砂，1757-1760)。生物芯片是目前基 因组学，蛋白质组学研究的重要工具，具有高通量，并对检测样品消耗量 少等优点(基因生物学，Ge画e編.2001， 2， research0004.1 0004.13)。 但目前，糖类物质生物芯片主要以荧光为检测手段，因而在检测灵敏度， 选择性等方面尚具有一定的缺点；拓展糖类物质生物芯片的检测手段对其 发展有重要意义(A^we， 2007，《437-444)。将金纳米粒子标记糖类物 质生物芯片和共振光散射光谱检测糖类物质生物芯片方法相结合，有助于 提高糖类物质生物芯片的灵敏度，重现性和选择性。
技术实现思路
以多肽混合物(胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与胱氨酰丙 氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸)修饰金纳米粒子具有合成方法简单，快速并且稳定性好，生物相容性好等优点。而亲和素-生物素(avidin-biotin)是目前发现的最稳定的配合物。本专利技术利用 亲和素-生物素反应以多肽(胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与 胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸) 修饰的金纳米粒子标记物；通过荧光染料修饰亲和素与生物素反应标记糖 类物质生物芯片，并结合表面银增强技术以RLS为检测手段，研制一种新 型的糖类物质生物芯片；并实现单糖，糖蛋白检测以及糖类物质与相应凝 集素之间相互作用的研究。本专利技术的目的是提供。(1)以 多肽修饰的金纳米粒子作为糖类物质生物芯片的标记物；(2)以共振光散 射光谱法为糖类物质生物芯片的检测手段；(3)通过亲和素与生物素反应 标记反应过程。实现本专利技术方法的具体技术方案如下1) 多肽修饰金纳米粒子的合成胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸，按摩尔比9:1制备多 肽混合物的混合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混 合物以摩尔比l: 50000混合，室温反应l-2小时后，在转速为13000转/ 分钟的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；将多 肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中4 °C下保存；2) 制作糖类物质生物芯片由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayer 48芯片制作系统上制作并处理糖类物质生物芯片点样量为lnL/点；为获得好的阵列点并 保持生物分子的活性，点样液为含有体积浓度为40%的甘油，体积浓度为0.005%的吐温-20 (Tween-20) ， pH-8.5的0.15 M NaCl和0.3 M磷酸盐 缓冲溶液；在温度为25 。C，湿度为75 %反应12小时；用1% (w/v)牛血清 蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片后得到糖类物质生物芯片；所述的 糖类物质为单糖或糖蛋白；3) 标记糖类物质生物芯片将步骤2)制作好的糖类物质生物芯片分别与25.6pg/ml-100iig/mL的生 物素标记的凝集素，浓度为50pg/mL亲和素(avidin)和浓度为2.5x10—9 M 的步骤1)制得的多肽修饰的金纳米粒子溶液，在37 。C反应l小时，之 后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干，得到标记的糖类物质生物芯片；4) 银增强反应为了进一步提高检测灵敏度，滴加即制即用的银增强溶液使其完全覆 盖在步骤3)标记后的糖类物质生物芯片上，反应5-10分钟，用18.2 MQ 水冲洗得到信号增强糖类物质生物芯片；所述的银增强溶液是将美国西格 玛(Sigma)公司生产的银增强溶液A与银增强溶液B按体积比1:1混合所得；5) 以RLS检测糖类物质生物芯片将步骤4)信号增强后所得的糖类物质生物芯片放入美国TdeChem. International Inc.公司生产的色度阵列扫描仪(Arraylt SpotWare Colorimetric Microarray Scamier)检测，得到糖类物质生物芯片的共振光散射光谱(RLS)有益效果(1)本专利技术提供的方法具有通用性，并具有灵敏度高，达到32ng/mL，选择性好以及样品消耗量少的特点。应用本方法可实现对单 糖，糖蛋白检测以及糖类物质与相应凝集素之间相互作用的研究。(2)本专利技术提供一种多肽修饰金纳米粒子标记方法，与其他金纳米粒 子标记方法相比具有简单，稳定，检测限低等优点。利用这一方法所获得 的单糖(Gal-P)检测限为8 ^M，凝集素(RCA 120)检测限为100 pg/mL; 二者的线性范围均为3个数量级，见表l。表l.单孝軎芯片RLS检测或荧光检测相应的检测限以及线性范围<table>table see original document page 7</column></row><table>这一方法所获得的糖蛋白(Asf)检测限为32 ng/ml，凝集素(RCA120) 的检测限为25.6pg/mL; 二者的线性范围均为3个数量级，见表2。 表2.糖蛋白芯片RLS检测或荧光检测相应的检测限以及线性范围<table>table see original document page 7</column></row><table>ConA 0.5ng/ml 1-1000 ng/ml 100ng/ml 0.5-10 ng/ml附图说明图1是用本专利技术的方法所获得的蓖麻凝集素-120浓度为1.5 ^g/ml时， 4-氨基苯基-p-D-半乳吡喃糖苷检测的标准曲线图。图2是本专利技术的方法所获得不同浓度蓖麻凝集素-120与25 mM Gal-|3 相互作用检测的标准曲线图。图3是用本专利技术的方法所获得的蓖麻凝集素-120浓度为2 Mg/ml时， 无唾液酸胎球蛋白(Asf)检测的标准曲线图图4是不同浓度蓖麻凝集素-120与250 )ag/mlAsf相互作用检测的标准 曲线图。 具体实施例方式实施例1: 4-氨基苯基-a-D-甘露吡喃糖苷(Man-a)的标记和检测(1) 多肽修饰金纳米粒子的合成胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天 门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸按摩尔比9:1制备多肽 混合物的混合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混合 物以摩尔比l: 50000混合，室温反应1-2小时后，在转速为13000转/分 钟( 16100g)的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒 子；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中4 °C下保存；(2) 制作糖类物质生物芯片由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartAr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型糖类物质生物芯片标记与检测方法，其步骤和条件为：　１）多肽修饰金纳米粒子的合成　胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰（生物素）甘氨酸，按摩尔比９∶１制备多肽混合物的混 合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混合物以摩尔比１∶５００００混合，室温反应１－２小时后，在转速为１３０００转／分钟的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中４℃下保存；　２）制作糖类物质生物芯片　由北京博奥生物技术有限公司提供的ＳｍａｒｔＡｒｒａｙｅｒ　４８芯片制作系统上制作并处理糖类物质生物芯片：点样量为１ｎＬ／点；为获得好的阵列点并保持生物分子的活性，点样液含有：体积浓度为４０％的 甘油，体积浓度为０．００５％的吐温－２０，ｐＨ＝８．５的０．１５Ｍ　ＮａＣｌ和０．３Ｍ磷酸盐缓冲溶液；在温度为２５℃，湿度为７５％反应１２小时；用重量体积浓度为１％的牛血清蛋白以及０．１Ｍ乙醇胺封闭芯片后得到糖类物质生物芯片；所述的糖类物质为单糖或糖蛋白；　３）标记糖类物质生物芯片　将步骤２）制作好的糖类物质生物芯片分别与２５．６ｐｇ／ｍｌ－１００μｇ／ｍＬ的生物素标记的凝集素，浓度为５０μｇ／ｍＬ亲和素和浓度为２．５×１０↑［－９］Ｍ的步骤１）制得的多肽修饰的金 纳米粒子溶液，在３７℃反应１小时，之后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干，得到标记的糖类物质生物芯片；　４）银增强反应　为了进一步提高检测灵敏度，滴加即制即用的银增强溶液使其完全覆盖在步骤３）标记后的糖类物质生物芯片上，反应５－１０ 分钟，用１８．２ＭΩ水冲洗得到信号增强糖类物质生物芯片；所述的银增强溶液是将美国西格玛（Ｓｉｇｍａ）公司生产的银增强溶液Ａ与银增强溶液Ｂ按体积比１∶１混合所得；　５）以共振光散射光谱检测糖类物质生物芯片　将步骤４）信号增强后所得 的糖类物质生物芯片放入美国ＴｅｌｅＣｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ．公司生产的色度阵列扫描仪检测，得到糖类物质生物芯片的共振光散射光谱检测信号。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王振新，高晶清，刘殿骏，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]