一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针及其制备方法与应用，属于核酸杂交技术领域，其探针的碱基序列结构如SEQ ID NO.1所示，制备过程包括设计引物、构建重组质粒、单克隆培养、送测与比对、跑凝胶电泳回收纯化、体外转录合成探针、试剂盒纯化探针。通过本发明专利技术的制备方法制得的PPIB RNA原位杂交探针的稳定性较好，能够长期保存使用，同时，本发明专利技术的制备方法下制备的小鼠PPIB RNA原位杂交探针具有信噪比高、特异性好、制备成本低且简单的特点，有利于商业化的推广应用。有利于商业化的推广应用。有利于商业化的推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及核酸杂交
，尤其是涉及一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]基因表达和分布的检测分析现已广泛应用于生物科学的研究以及临床医学的应用中。目前在转录水平对目标基因的表达和分布进行分析的方法，有实时荧光定量PCR、RNA印迹，基因芯片、原位杂交等，这些技术都依赖于内参基因的选择。然而荧光定量PCR、RNA印迹，基因芯片等技术仅能反映基因的表达，原位杂交技术能同时反映基因的表达和分布情况。
[0003]荧光原位杂交技术是在原位杂交技术上发展起来的非放射性分子实验技术，它根据碱基互补配对的原则设计一段与目标组织或者细胞中的RNA能特异性结合的RNA探针，通过显微成像将结果呈现出来。这项技术的准确性很大程度上取决于组织样品中RNA的质量。常使用内参基因作为判定样品RNA质量的标准，一个理想的内参基因、具有表达量高，分布广泛，表达稳定的特点。大量的研究分析表明，内参基因的稳定性也是相对的，在不同细胞不同时期，不同组织中内参基因的表达并不是恒定不变的。
[0004]PPIB(peptidyl
‑
prolyl isomerase B，肽基脯氨酰基异构酶B)也称为亲环素B(cyclophilin B)。亲环素B在体内的分布十分广泛，研究表明PPIB是一种表达相对稳定的内参基因，比ACTB以及GAPDH，更适合作为内参基因。
[0005]基于PPIB作为内参基因的广泛应用，现有的PPIB荧光探针的选用，通常采用RNAscope ACD试剂盒，其价格昂贵，货期较长，且及时性较差。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针及其制备方法与应用，以解决现有技术中采用RNAscope ACD试剂盒作为PPIB荧光探针的应用，其价格昂贵，货期较长，且及时性较差的技术问题。
[0007]本专利技术提供一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列结构。
[0008]进一步，所述RNA探针的长度不小于500nt。
[0009]本专利技术还提供了如上述的RNA探针的制备方法，包括如下步骤：
[0010]Sp1：设计引物：根据PPIB的碱基序列设计引物，得到正向引物和反向引物，且正向引物和反向引物的序列如下：
[0011]正义链：acagtggataattttgtagc，
[0012]反义链：gtgtggggattgacagg；
[0013]Sp2：PCR扩增PPIB探针序列，并电泳跑胶纯化，以3:1的浓度，连接PPIB PCR产物以及pGM
‑
T载体，转化感受态细胞得到pGM
‑
T
‑
PPIB克隆；
[0014]Sp3：单克隆培养：挑取10个PGM
‑
T
‑
PPIB单克隆与大肠杆菌混合培养；
[0015]Sp4：从上述单克隆样品中，选取3个培养成功的样品进行送测，比对测序结果与PPIB序列，判断比对结果是否符合预期；
[0016]Sp5：用上述测序结果符合预期的重组质粒作为模版，进行单酶切，并跑胶回收酶切产物，得到线性化的重组质粒；
[0017]Sp6：用上述线性化重组质粒作为模版进行体外转录，合成带有地高辛标记的反义RNA探针，即为PPIB的RNA探针；
[0018]Sp7：使用探针纯化试剂盒纯化PPIB探针。
[0019]本专利技术另外提供了如上述的RNA探针的应用，用于检测小鼠的内参基因PPIB，该方法包括如下步骤：
[0020]步骤一：杂交前处理：取待检测的组织样本进行预处理；
[0021]步骤二：预杂交：向预处理过的组织样本上加入预杂交液，覆盖住组织，并放入烘箱孵育；
[0022]步骤三：杂交：吸走预杂交液，向切片上加入所述RNA探针，覆盖组织，并放入烘箱孵育；
[0023]步骤四：一抗标记：弃去杂交液，漂洗样本，加入地高辛抗体，进行孵育；
[0024]步骤五：显色：弃去地高辛抗体，漂洗样品，加入显色底物室温避光孵育；
[0025]步骤六：复染封片：加入含DAPI的封片液，室温晾干；
[0026]步骤七：镜检观察：在显微镜下拍照观察。
[0027]与现有技术相比较，本专利技术的有益效果在于：
[0028]本专利技术中，通过本专利技术的制备方法制得的PPIB RNA原位杂交探针的稳定性较好，能够长期保存使用。同时，本专利技术的制备方法下制备的小鼠PPIB RNA原位杂交探针具有信噪比高、特异性好、制备成本低且简单的特点，有利于商业化的推广应用。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1为本专利技术中制得的PPIB RNA原位杂交探针显示在凝胶上的碱基序列条带示意图；
[0031]图2为本专利技术中显示pGM
‑
T载体图谱以及酶切位点的示意图；
[0032]图3为本专利技术中显示pSPT19载体条带以及重组质粒pSPT19
‑
WPRE的条带示意图；
[0033]图4为本专利技术方法下制得的探针进行原位杂交检测的结果，白色亮点为PPIB RNA探针在小鼠脑组织中的特异性表达的示意图；
[0034]图5为本专利技术的连接体系表；
[0035]图6为本专利技术的pGM
‑
T
‑
PPIB酶切体系表。
具体实施方式
[0036]下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0037]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术的技术方案作进一步完整详细地说明。以下所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。
[0038]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0039]基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0040]具体实施例1：
[0041]本实施例介绍了PPIB基因片段的合成：
[0042]1、设计引物：根据PPIB的碱基序列设计得到引物PPIB
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F1和PPIB
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R1：
[0043]PPIB
‑
F：acagtggataatttt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针，其特征在于：具有SEQ IDNO.1所示的碱基序列结构：Acagtggataattttgtagccttagctacaggagagaaaggatttggctacaaaaacagcaagttccatcgtgtcatcaaggacttcatgatccagggtggagacttcaccaggggagatggcacaggaggaaagagcatctatggtgagcgcttcccagatgagaacttcaagctgaagcactacgggcctggctgggtgagcatggccaatgcaggcaaagacaccaatggctcacagttcttcataaccacagtcaagacctcctggctggatggcaagcatgtggttttcggcaaagttctagagggcatggatgtggtacggaaggtggagagcaccaagacagacagccgggacaagccactgaaggatgtcatcattgtcgactccggcaagatcgaagtggagaaacccttcgccattgccaaggagtagagagcctgggggacctcatccctctaagcagctgtctgtgtgggtcctgtcaatccccacac。2.根据权利要求1所述的RNA探针，其特征在于：所述RNA探针的长度不小于500nt。3.一种如权利要求1所述的RNA探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：Sp1：设计引物：根据PPIB的碱基序列设计引物，得到正向引物和反向引物，且正向引物和反向引物的序列如下：正义链：acagtggataattttgtagc，反义链：gtgtggggattgacagg；Sp2：构建重组质粒：使用上述引物进行PCR扩增PPIB部分碱基序列，将所述PCR产物连接到载体上，得到重组质粒克隆；Sp3：单克隆培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜舒，来香茹，江颖纯，罗玉珠，徐玲，梁佳莹，
申请(专利权)人：深圳市恩辑生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：