一种迷你启动子pAPP及其应用制造技术

本发明专利技术属于神经工程技术领域，具体涉及一种在神经元细胞特异性高效表达的迷你启动子pAPP。本发明专利技术提供了一种迷你启动子pAPP及其应用，所述启动子pAPP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术另一方面提供了应用该启动子pAPP在重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒、重组腺相关病毒的试剂盒、基因治疗载体中，以及在制备操控神经细胞、基因编辑和/或基因治疗试剂中的应用。本发明专利技术提供的迷你启动子pAPP使外源基因得以在全脑范围内的神经元中高效表达，在基因编辑和基因治疗领域具有广泛的应用前景。用前景。用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种迷你启动子pAPP及其应用


[0001]本专利技术属于神经工程
，具体涉及一种迷你启动子pAPP及其应用。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(AAV)是一种无包膜的单链DNA病毒。重组腺相关病毒(rAAV)是在野生型AAV基础上改造而成的重组型病毒。重组腺相关病毒由于其具有能介导基因在哺乳动物体内长期稳定表达、免疫原性低、宿主范围广等优点，是神经科学领域中和临床神经系统疾病基因治疗中广泛使用的基因递送载体。
[0003]在应用rAAV于神经科学研究及临床治疗的过程中，提高目的基因表达的时空特异性和表达水平是基因递送的关键。调控外源基因表达的策略直接影响了基因递送的效率和安全性。对于神经系统疾病的基因治疗而言，若要干预不同的神经系统疾病，就要对全脑或不同亚型的神经元进行操纵。其中一个重要的方法是选择不同血清型的rAAV病毒。目前已有的报道中，适用于神经系统的rAAV血清型包括：1型、2型、5型、6型、8型、9型、DJ、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、Retro、rh10等十几种。不同血清型的病毒对不同的脑区具有不同的亲和性、感染效率及扩散能力，因此，我们可以根据研究对象及治疗靶点，选择不同的rAAV血清型作为基因递送载体。然而，鉴于中枢神经系统的复杂性，这些血清型远远无法满足当前基因递送特异性的需求。另一种方法是在rAAV基因组中应用组织特异性的启动子。启动子是基因表达调控过程中必要的顺式作用元件。在具有表达特异性启动子的调控下，外源基因一般只在某些特定的细胞类型或脑区中表达。在rAAV中使用特异性启动子来驱动基因表达，能提高基因表达的效率，降低rAAV感染过程中产生的免疫反应。
[0004]rAAV是递送治疗性基因元件至中枢神经系统的可靠病毒载体，但有两个重要因素阻碍了其在基因治疗策略中的开发应用。首先，rAAV的最大包装容量为5.2kb，极大限制了大的治疗性基因元件在单一AAV载体中的包装；其次，rAAV的低靶向性也是限制发展rAAV病毒工具的难题。目前常用的神经元特异性启动子hSyn大小为485bp，这一启动子长度在单一AAV载体的前提下进一步限制了功能蛋白的包装容量。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在提供一种迷你启动子pAPP及其应用。所述迷你启动子pAPP长度仅为120bp，能适用在重组腺相关病毒中，使外源基因得以在神经元细胞中高效表达，在基因编辑和基因治疗领域具有广泛的应用前景。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术的第一目的是提供一种在神经元细胞特异性高效表达的迷你启动子pAPP，所述启动子pAPP长度为120bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]CTCTCGGGTGCCGAGCGGGGTGGGCCGGATCAGCTGACTCGCCTGGCTCTGAGCCCCGCCGCCGCGCTCGGGCTCCGTCAGTTTCCTCGGCAGCGGTAGGCGAGAGCACGCGGAGGAGCG(SEQ ID NO：1)
[0009]本专利技术的第二目的是提供一种含有上述启动子的重组腺相关病毒载体。
[0010]优选的，所述重组腺相关病毒载体采用pAAV
‑
hSyn
‑
X作为骨架载体，将该载体中hSyn替换为pAPP启动子，得到重组腺相关病毒载体pAAV
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pAPP
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X，X是需要表达的蛋白序列。
[0011]优选的，所述重组腺相关病毒载体为pAAV
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pAPP
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荧光蛋白、pAAV
‑
pAPP
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功能性蛋白或pAAV
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pAPP
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治疗性蛋白中的一种；所述荧光蛋白为eYFP或tdTomato；所述功能性蛋白为光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白。
[0012]所述pAAV
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pAPP
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荧光蛋白可以实现特异性细胞感染示踪；pAAV
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pAPP
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功能性蛋白可以用于制备激活或者抑制特定神经元的重组腺相关病毒；pAAV
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pAPP
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治疗性蛋白可以用于基因治疗。
[0013]优选的，所述的重组腺相关病毒载体pAAV
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pAPP
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X的制备方法，包括以下步骤：
[0014](1)将启动子pAPP基因片段两端分别加上限制性内切酶MluI
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HF和BamHI
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HF识别位点后人工合成；
[0015](2)采用限制性内切酶MluI
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HF和BamHI
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HF处理pAAV
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hSyn
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X载体，同时用限制性内切酶MluI
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HF和BamHI
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HF处理pAPP片段；
[0016](3)对两种酶切产物进行回收、纯化、连接，得到重组腺相关病毒载体pAAV
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pAPP
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X。
[0017]本专利技术的又一目的是提供一种含有上述启动子或上述重组腺相关病毒载体的重组腺相关病毒。
[0018]所述重组腺相关病毒AAV
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PHP.B
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pAPP
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eYFP、AAV
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PHP.B
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pAPP
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tdTomato可以特异性地感染神经元细胞，并表达高荧光强度的eYFP或tdTomato。
[0019]本专利技术的又一目的是提供一种含有上述启动子或上述重组腺相关病毒载体或上述的重组腺相关病毒的试剂盒。
[0020]进一步地，本专利技术另一方面提供了所述启动子或重组腺相关病毒载体或重组腺相关病毒或重组腺相关病毒的试剂盒在制备操控神经细胞、基因编辑和/或基因治疗试剂中的应用。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0022](1)本专利技术迷你启动子pAPP长120bp，且在神经元细胞中具有高效表达效率，在神经元可以实现外源基因高效表达，提高病毒感染后的表达特异性，其在基因编辑和基因治疗领域具有广泛的应用前景；
[0023](2)本专利技术启动子pAPP在细菌和哺乳动物细胞中无细胞毒性；
[0024](3)本专利技术重组腺相关病毒载体采用pAPP作为启动子，具有更大的包装能力，在兴奋性及抑制性神经元均具有高效表达效率；
[0025](4)本专利技术重组腺相关病毒可以在全脑范围内感染神经元细胞，包括皮层、海马及中脑都能驱动eYFP高水平表达。
附图说明
[0026]图1为pAAV
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pAPP
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eYFP载体的构造流程图。
[0027]图2为AAV
‑
PHP.B...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在神经元细胞特异性高效表达的迷你启动子pAPP，其特征在于，所述启动子pAPP长度为120bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种含有权利要求1所述启动子的重组腺相关病毒载体。3.根据权利要求2所述重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体采用pAAV
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hSyn
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X作为骨架载体，将该载体中hSyn替换为pAPP启动子，得到重组腺相关病毒载体pAAV
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pAPP
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X，X是需要表达的蛋白序列。4.根据权利要求2所述重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体为pAAV
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pAPP
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荧光蛋白、pAAV
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pAPP
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功能性蛋白或pAAV
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pAPP
‑
治疗性蛋白中的一种；所述荧光蛋白为eYFP或tdTomato；所述功能性蛋白为光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白。5.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体pAAV
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pAPP
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：路中华，陈晔菲，李田，
申请(专利权)人：深圳市恩辑生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：