一种快速评价引导编辑系统工作效率的方法技术方案

本申请提出了一种快速评价引导编辑系统工作效率的方法，涉及生物技术领域。针对目标基因设计特异性的打靶位点，构建引导编辑系统的载体，载体中包含过表达目标基因的载体随后转染细胞系，其中构建的载体上带有能够被流式细胞仪识别检测的荧光标记；对培养后的转染细胞提取DNA；针对打靶位点侧翼序列设计特异性引物，使得PCR扩增序列覆盖打靶位点，随后进行PCR扩增，获得细胞PCR扩增产物；将获得的PCR产物置于测序仪上进行高通量测序，获得编辑效率并鉴定编辑类型。在原有的基础上增加了体外过表达相关基因的载体，同时共转目标pegRNA和编辑酶，在细胞水平直接鉴定切割效率，节省了成本，灵敏度和精确度高。灵敏度和精确度高。灵敏度和精确度高。

【技术实现步骤摘要】
一种快速评价引导编辑系统工作效率的方法


[0001]本申请涉及生物
，具体而言，涉及一种快速评价引导编辑系统工作效率的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR
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cas9依赖sgRNA，引导Cas9核酸酶靶向DNA序列，从而产生双链断裂(DSB)，但在同时切割两个位点时，细胞DNA损伤修复因子通常通过非同源末端连接(NHEJ)连接基因组的两端而不涉及内含子序列。虽然功能强大，但这种方法有几个限制在试图诱导缺失，特别是长片段的缺失，通常会导致在DSB附近产生一个或两个的短插入或缺失(删除<10bp)，带有或没有预期的删除；DSBs是一种细胞毒性损伤；通过这种方法编程的基因组缺失连接受到自然发生的PAM位点分布的限制。尽管存在限制，但各种研究已经采用这种策略取得效果，例如，研究基因和调节元件的功能，以及基因治疗。然而，有限的精度、DSB毒性和无法对任意缺失进行编辑限制CRISPR
‑
Cas9诱导的缺失在功能和治疗基因组学中的实用性。
[0003]引导编辑(Prime editing，PE)系统是一种最新的基因定点编辑技术，利用nSpCas9(H840A)和工程化改造M
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MLV RT逆转录酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)融合构建引导编辑器(prime editor)，由pegRNA(prime editing guide RNA)中guide RNA部分引导在人细胞基因组靶位置附近形成编辑链上的单链切口，进而通过pegRNA中的PBS(primer binding site)序列引导以含有目标编辑序列的逆转录模板(RT template)将突变精确导入基因组中。由于此系统可完成的编辑类型更为广泛，不仅可以实现12种任意类型的碱基替换，还可精确高效地导入44bp以内的小片段插入、80bp以内的片段缺失以及复杂形式混合突变；同时受PAM的限制相对较小，在长达33nt的PAM远端序列内，多个位点都可以高效精准的编辑，当在目标位点附近有多个相同碱基时，不会受到碱基编辑器旁观者突变(bystander mutation)问题的困扰，所以其在人类疾病治疗、植物和微生物等领域的应用越来越广泛。

技术实现思路

[0004]本申请的目的在于提供一种快速评价引导编辑系统工作效率的方法，在原有的基础上增加了体外过表达相关基因的载体，同时共转目标pegRNA和编辑酶，在细胞水平直接鉴定该pegRNA的切割效率，极大地节省了经济和时间成本，灵敏度和精确度极高。
[0005]本申请解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0006]本申请实施例提供一种快速评价引导编辑系统工作效率的方法，其包括以下步骤：
[0007]S1针对目标基因设计特异性的打靶位点，构建引导编辑系统的载体，所述载体中包含过表达目标基因的载体，随后转染细胞系；
[0008]S2对培养后的转染细胞提取DNA；
[0009]S3针对打靶位点侧翼序列设计特异性引物，使得PCR扩增序列覆盖打靶位点，用S2中的DNA作为模板，进行PCR扩增，获得细胞PCR扩增产物；
[0010]S4将S3步骤中获得的PCR产物置于测序仪上进行高通量测序，获得碱基插入或缺失的编辑效率并鉴定编辑类型。
[0011]相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：
[0012]目前，应用引导编辑系统进行基因编辑主要是利用nSpCas9(H840A)和工程化改造M
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MLV RT逆转录酶(moloney murine leukemia virus reversetranscriptase)融合构建引导编辑器(prime editor)，由pegRNA(prime editingguide RNA)中guide RNA部分引导在人细胞基因组靶位置附近形成编辑链上的单链切口，进而通过pegRNA中的PBS(primer binding site)序列引导以含有目标编辑序列的逆转录模板(RT template)将突变精确导入基因组中。
[0013]本申请提供的一种快速评价引导编辑系统工作效率的方法在原有的基础上增加了体外过表达相关基因的载体，同时共转目标pegRNA和编辑酶，在细胞水平直接鉴定该pegRNA的切割效率，极大地节省了经济和时间成本，灵敏度和精确度极高。该方法相较于现有的方法，不需要体外转录及显微注射，体外转录及显微注射需要昂贵试剂和仪器还需熟练的操作人员，检测周期长。运用该方法，可以先检测相关pegRNA是否有编辑效率再应用于大型动物改造相关基因提高经济效益。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0015]图1为本申请实施例荧光成像结果图；
[0016]图2为本申请实施例流式细胞仪检测eGFP基因FITC
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A
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Mean的结果图；
[0017]图3为本申请实施例琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
[0018]图4为本申请实施例pU6
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eGFP
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pegRNA序列对比结果图；
[0019]图5为本申请实施例pU6
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eGFP
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pegRNA的测序峰图；
[0020]图6为本申请实施例U6
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eGFP
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ngRNA序列对比结果图；
[0021]图7为本申请实施例U6
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eGFP
‑
ngRNA的测序峰图。
[0022]图3中各数字和字母含义如下：
[0023]1：pCMV
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PE2质粒+plex
‑
eGFP质粒+pU6
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pegRNA
‑
GG
‑
acceptor质粒；
[0024]2：pCMV
‑
PE2质粒+plex
‑
eGFP质粒+pU6
‑
eGFP
‑
pegRNA质粒；
[0025]3：pCMV
‑
PE2质粒+plex
‑
eGFP质粒+pU6
‑
pegRNA
‑
GG
‑
acceptor质粒+ngRNA质粒；
[0026]4：pCMV
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PE2质粒+plex
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eGFP质粒+pU6
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eGFP
‑
pegRNA质粒+U6...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速评价引导编辑系统工作效率的方法，其特征在于，其包括以下步骤：S1针对目标基因设计特异性的打靶位点，构建引导编辑系统的载体，所述载体中包含过表达目标基因的载体，随后转染细胞系；S2对培养后的转染细胞提取DNA；S3针对打靶位点侧翼序列设计特异性引物，使得PCR扩增序列覆盖打靶位点，用S2中的DNA作为模板，进行PCR扩增，获得细胞PCR扩增产物；S4将S3步骤中获得的PCR产物置于测序仪上进行高通量测序，获得碱基插入或缺失的编辑效率并鉴定编辑类型。2.根据权利要求1所述的快速评价引导编辑系统工作效率的方法，其特征在于，所述S1中载体为通过在骨架载体pU6
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pegRNA
‑
GG
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acceptor和Cas9 sgRNA上插入目标pegRNA和ngRNA序列改造而成。3.根据权利要求1所述的快速评价引导编辑系统工作效率的方法，其特征在于，所述S1中被转染的细胞选自293T细胞系。4.根据权利要求1所述的快速评价引导编辑系统工作效率的方法，其特征在于，所述S1中过表达目标基因的载体上带有能够被流式细胞仪识别检测的荧光标记，转染的细胞培养48
‑
72h后，进...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱梅玉，张雪梅，张宁，徐鑫，彭新荣，李文蓉，刘明军，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院生物技术研究所新疆畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心，
类型：发明
国别省市：