一种编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料及其在制备FecB基因型绵羊胚胎中的应用，包括如SEQ ID NO.1所示的FecB

【技术实现步骤摘要】
一种编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种基于同源重组高效制备绵羊FecB基因型胚胎的方法及其应用。

技术介绍

[0002]FecB基因最早是在Booroola绵羊上发现的，也是目前研究最为成熟的控制绵羊高繁殖力的主效基因。FecB基因位于绵羊6号染色体区域，是骨形态发生蛋白受体IB基因(bone morphogenetic protein
‑
IB gene,BMPR
‑
IB)的突变体形式，该基因编码序列长1509bp，由10个外显子组成，编码502个氨基酸，其编码区746碱基(A
→
G)的突变，而编码谷氨酰胺密码子则变成精氨酸密码子(Q249R)，该位点突变与布鲁拉羊、湖羊、小尾寒羊、中国美利奴羊多胎品系及策勒黑羊等品种高繁殖力性状密切相关。一个拷贝的FecB基因平均可增加排卵数1.65个，增加产羔数0.9
‑
1.2只；两个拷贝平均增加排卵数2.7
‑
3.0个，增加产羔数1.1
‑
1.7只。因此，高繁殖力绵羊品种(系)的育种往往是在基因组中导入FecB基因。利用基因编辑技术，可实现不改变基因组背景的条件下的，可进行精准的分子育种，对目标基因进行改造而获得目标基因型的种质资源，对FecB基因型精准编辑可获得高繁殖力的种质资源。目前，已报道CRISPR/Cas9技术获得的基因编辑绵羊，所采用的编辑物质导入受精卵方法均为显微注射法，该方法不仅具有费时费力，需要训练的显微操作人员和显微操作技术，严重限制了该技术的广泛应用。而电穿孔技术是利用电流来增加细胞膜的可透性,高效快速地将外源物质转入受精卵中，不仅操作简便，还具有效率高，规模化应用等优点。目前尚未见到利用电转和同源重组高效制备绵羊FecB基因型胚胎的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9系统编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料，包括FecB
‑
sgRNA和FecB
‑
ssODN，sgRNA和ssODN共同作用完成羊FecB基因精准编辑。
[0004]本专利技术提供了一种编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料，包括如SEQ ID NO.1所示的FecB
‑
sgRNA序列和如SEQ ID NO.2所示的FecB
‑
ssODN序列。
[0005]优选地，所述编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料还包括Cas9核酶和scr7。
[0006]进一步优选地，所述编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料，包括FecB
‑
sgRNA50
‑
100ng/ul,Cas9 100
‑
200ng/ul,FecB
‑
ssODN 50
‑
100ng/ul,scr71
‑
2.5uM。
[0007]本专利技术还提供上述同源重组基因编辑材料在制备FecB基因型绵羊胚胎中的应用，包括以下步骤：
[0008]绵羊卵母细胞进行体外成熟培养，体外受精处理，将所述的基因同源重组基因编辑材料溶解于Opti
‑
MEM混合做为电转材料，将受精卵移至电转材料中进行电转，电转处理后的受精卵移至胚胎培养液中继续培养扩增。
[0009]通过电转化上述同源重组基因编辑材料，可高效制备FecB基因型绵羊胚胎，为培
育高繁殖力绵羊品种提供技术方法。
[0010]优选地，电转所用电极特征为1mm间隙。
[0011]优选地，电转参数：打孔电压35
‑
40V,时长1
‑
2ms，间隔50ms，脉冲4
‑
5次，衰减率10％，极性“+”；转移电压5
‑
7V，时长50ms，间隔50ms，脉冲4
‑
5次，衰减率40％，极性“+/
‑”
。
[0012]优选地，体外受精处理6
‑
10h。
[0013]优选地，每次电转所用的受精卵数量为20
‑
30枚。
[0014]优选地，所述绵羊受精卵不含有FecB基因。
[0015]有益效果，本专利技术提供了编辑绵羊BMPRIB基因的sgRNA和ssOND组合，通过电转受精卵导入编辑材料，可进行精准点突变成为FecB基因，即可实现BMPRIB基因编码区746碱基A精准突变为G。以裂解胚胎为模板进行PCR预扩增，预扩增产物为模板，分别进行酶切验证引物PCR扩增和测序PCR引物扩增，结果显示，所获得电转胚胎中，发生编辑的胚胎比率高达84％以上，发生同源重组的点突变在70％以上，胚胎完全精准点突变的可达25％。本专利技术能够实现高效快速获得FecB基因型胚胎，在不改变品种其它性状基因构成的基础上，为培育高繁殖力的绵羊品种提供技术支持。
[0016]附图表说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0018]图1为本专利技术流程图；
[0019]图2为编辑胚胎PCR扩增AvaII酶切产物电泳图。
具体实施方式
[0020]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]实施例1一种编辑绵羊FecB基因的同源重组基因编辑材料
[0022]一种编辑绵羊FecB基因的同源重组组份，包括如SEQ ID NO.1所示的FecB
‑
sgRNA序列和如SEQ ID NO.2所示的FecB
‑
ssODN序列。
[0023]本专利技术的sgRNA的核苷酸序列，从5
’‑3’
依次如下：
[0024]FecB
‑
sgRNA(SEQ ID NO.1):
[0025]AGAGACAGAAAUAUAUCAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
[0026]FecB
‑
ssODN(SEQ ID NO.2)：
[0027]ACAGAGGAGGCCAGCTGGTTCCGAGAGACAGAAATATATCGGACCGTGTTGATGA GGCATGAAAACATCTTGGGTGAGTATAAGT
[0028]本专利技术根据绵羊BMPRIB基因(GENBANK ID：NM_001009431.1)编码区746A
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的FecB
‑
sgRNA序列和如SEQ ID NO.2所示的FecB
‑
ssODN序列。2.根据权利1所述的编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料，其特征在于，还包括Cas9核酶。3.根据权利2所述的编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料，其特征在于，还包括scr7。4.根据权利要求3所述的编辑绵羊FecB基因同源重组基因编辑材料，其特征在于，FecB
‑
sgRNA50
‑
100ng/ul,Cas9100
‑
200ng/ul,FecB
‑
ssODN50
‑
100ng/ul,scr71
‑
2.5uM。5.权利要求1
‑
4任一权利要求所述的同源重组基因编辑材料在制备FecB基因型绵羊胚胎中的应用，其特征在于，包括以下步骤：绵羊卵母细胞进...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴阳升，陈莹，汪立芹，林嘉鹏，黄俊成，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院生物技术研究所新疆畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心，
类型：发明
国别省市：