【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种绵羊胚胎性别鉴定巢式pcr引物及其应用。
技术介绍
1、家畜胚胎的早期性别鉴定技术是实现家畜性别控制的一种重要方法。动物的某些生产性状是受性别限制（如泌乳等）或性别影响的（如产毛等）。从而通过性别控制达到理想的性别比例；通过移植己知性别的胚胎，控制家畜后代的性别。这些人为措施能加快优良母畜的繁殖速度，促进高效畜牧业的发展。因此，对绵羊早期胚胎进行性别鉴，在生产中不仅可以促进优良绵羊基因的推广、加速品种改良，还是性控胚胎生产技术研发、不同性别胚胎发育机制研究的重要检测手段，具有重要的科学研究价值。虽然pcr聚合酶链式反应（pcr）技术在绵羊早期胚胎性别鉴定中已取得了突破性的进展，用sry和或牙釉蛋白基因的引物进行pcr扩增可以进行性别鉴定，仍存在因胚胎细胞量太少和非特异性扩增等因素造成灵敏度及准确性不高的技术问题。因此，开发出一种高灵敏度、高准确性的绵羊胚胎性别鉴定引物和pcr体系尤为重要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于：提供一种绵羊早期胚胎性别鉴定的特异性pcr扩增引物，以及提供一种绵羊早期胚胎性别鉴定pcr方法，利用内外部引物，采用巢式pcr反应体系，第一轮扩增解决细胞数量少的灵敏度，第二轮扩增解决特异性，解决了一次pcr由于胚胎细胞量太少扩增失败或者非特异性扩增造成判断失败的技术问题；提供了一种更加准确，更加灵敏的绵羊单细胞性别鉴定技术。
2、为达到上述专利技术目的，本专利技术提供的具体方案如下：一种用于绵羊胚胎性别鉴
3、一种用于绵羊胚胎性别鉴定的特异性目标片段a1和b1，分别以权利要求1中的a和b片段为模板，扩增目标片段a1，a1片段为绵羊x染色体二次扩增产物，大小为175bp，如seqid no.7所示，扩增目标片段b1，b1片段为绵羊y染色体二次扩增产物，大小为130bp，如seqid no.8所示。
4、一种用于扩增a和b片段的外部引物对，其上游引物f1，5-catggtgccagctcagcag-3，如seq id no.1所示，下游引物r1，5-ccgcttggtcttgtctgttgc-3，如seq id no.2所示。引物设计参考genbank id x染色体 xm_012106213.4 (amelx),y染色体 ay082494.1(amely)。
5、一种用于扩增a1和b1片段的内部引物对，其上游引物f2，5-gcagcccttccagccccag-3，如seq id no.5所示，下游引物r2：5-cagaggttgcatggggaatat-3，如seq id no.6所示。引物设计参考genbank id x染色体xm_012106213.4(amelx),y染色体ay082494.1(amely)。
6、一种用于绵羊胚胎性别鉴定的pcr试剂盒，同时包含有外部引物对和内部引物对。
7、一种应用巢式pcr引物进行绵羊胚胎性别鉴定的应用方法，包括以下步骤:
8、(1)绵羊胚胎细胞的收集和裂解5μl；(2)以绵羊胚胎细胞裂解液为dna模板，进行第一轮pcr扩增，25μl反应体系包含：胚胎细胞裂解物5μl，2×pcr mix 12.5μl，外部引物对f1，r1各0.5μl，补水至25μl；扩增程序为：94℃ 3min，94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 20s，15个循环；72℃延伸1min；(3)以第一轮pcr扩增产物做模板，进行第二轮pcr扩增，25μlpcr反应体系包含：第一轮pcr产物1μl；2×pcr mix 12.5μl；内部引物对f2，r2各0.5μl；补水至25μl；扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸1min；所述第一轮扩增产物为a片段和b片段；(4)第二轮扩增产物用3％的琼脂糖凝胶的电泳检测，根据电泳条带进行性别判定：若扩增条带仅有175bp，则判定该绵羊胚胎为雌性，若同时有175bp和130bp的两条扩增条带，则判定该绵羊胚胎为雄性；所述第二轮扩增产物为a1片段和b1片段。
9、进一步地本专利技术还提供了一种绵羊早期胚胎性别鉴定的pcr试剂盒，采用上述的内外部两对特异性引物对，内参和特异引物共用，试剂盒中除了引物外的其他成分，都可以根据现有技术进行设计添加。
10、有益效果，本专利技术设计的引物对采用了巢式pcr技术，内标引物和性别特异性引物为共用引物，避免了多种引物导致的扩增效率差异等问题，第一轮扩增解决了样本的灵敏度和部分特异性问题，第二轮扩增进一步提高了灵敏度和特异性，极大的提高鉴定的准确率。利用绵羊胚胎性别鉴定巢式pcr引物及应用方法进行胚胎性别鉴定，可进行单细胞性别鉴定，准确率在99%以上。为性控胚胎生产探索出一条新的途径。
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1.一种用于绵羊胚胎性别鉴定的特异性目标片段A和B，其特征在于：A片段为X染色体扩增产物，大小为349bp，如SEQ ID NO.3所示，B片段为Y染色体扩增产物，大小为304bp，如SEQ ID NO.4所示。
2.一种用于绵羊胚胎性别鉴定的特异性目标片段A1和B1，其特征在于：分别以权利要求1中的A和B片段为模板，扩增目标片段A1，A1片段为X1染色体扩增产物，大小为175 bp，如SEQ ID NO.7所示，扩增目标片段B1，B1片段为Y1染色体扩增产物，大小为130bp，如SEQ IDNO.8所示。
3.一种用于扩增权利要求1所述的特异性目标片段的外部引物对，其上游引物F1，5-CATGGTGCCAGCTCAGCAG-3，如SEQ ID NO.1所示，下游引物R1，5-CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3，如SEQ ID NO.2所示。
4.一种用于扩增权利要求2所述的特异性目标片段的内部引物对，其上游引物F2，5-GCAGCCCTTCCAGCCCCAG-3，如SEQ ID NO.5所示，下游引物R2：5-CAGAGGTTGC
5.一种用于绵羊胚胎性别鉴定的PCR试剂盒，其特征在于：同时包含有权利要求3和权利要求4所述的特异性引物对。
6.一种应用巢式PCR引物进行绵羊胚胎性别鉴定的应用方法，其特征在于，包括以下步骤:
...【技术特征摘要】
1.一种用于绵羊胚胎性别鉴定的特异性目标片段a和b，其特征在于：a片段为x染色体扩增产物，大小为349bp，如seq id no.3所示，b片段为y染色体扩增产物，大小为304bp，如seq id no.4所示。
2.一种用于绵羊胚胎性别鉴定的特异性目标片段a1和b1，其特征在于：分别以权利要求1中的a和b片段为模板，扩增目标片段a1，a1片段为x1染色体扩增产物，大小为175 bp，如seq id no.7所示，扩增目标片段b1，b1片段为y1染色体扩增产物，大小为130bp，如seq idno.8所示。
3.一种用于扩增权利要求1所述的特异性目标片段的外部引物对，其上游引物f1，5-catggtgcc...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴阳升，林嘉鹏，陈莹，汪立芹，王旭光，马秀玲，张欣如，刘春洁，黄俊成，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院生物技术研究所新疆畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心，
类型：发明
国别省市：
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