一种发根农杆菌介导的桃果实愈伤瞬时遗传转化方法技术

技术编号：40028030 阅读：13 留言：0更新日期：2024-01-16 17:48

本发明专利技术公开了一种发根农杆菌介导的桃果实愈伤瞬时遗传转化方法，属于植物分子生物技术和基因工程技术领域。利用该遗传转化方法同源验证了桃氢过氧化物裂解酶PpHPL1基因的功能。该方法主要步骤如下：1)果实愈伤组织诱导与继代；2)表达载体构建和发根农杆菌转化；3)携带目标基因的发根农杆菌侵染愈伤组织；4)侵染后愈伤共培养及筛选；5)愈伤取样检测。本发明专利技术实现了不同品种桃果实愈伤诱导，建立了同源瞬时遗传转化体系，可用于基因功能验证及目标基因筛选，可应用于桃分子育种进程。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物组织培养领域、植物生物和基因工程领域。涉及一种发根农杆菌介导的桃果实愈伤瞬时遗传转化方法，是一种桃果实的愈伤组织诱导以及基因瞬时遗传转化的方法。

技术介绍

1、桃(prunus persica l.batsch)是一个二倍体物种，基因组较小，仅有265mb，是理想蔷薇科果树模式材料。研究者对不同外植体、遗传转化的手段、不同的细菌和农杆菌等因素进行探索以建立稳定的桃遗传转化体系，但成功获得转基因桃树的仅有三篇报道。成熟的遗传转化体系对桃的生物学研究、遗传育种和产业发展具有重要意义，在该领域仍需要大量的科研工作投入。

2、瞬时转化体系能在短时间内迅速验证相关基因的功能，同时也能节省大量的人力和物力。桃果实进行瞬时遗传转化时，过程涉及材料的筛选、清洗、无菌化处理以及果实造伤侵染等过程，桃果实不仅严重受制于季节性收获影响，也不耐贮藏。桃果实愈伤组织不受季节限制，同时在短期内能扩繁形成一定规模用于基因工程研究，相比较桃果实，愈伤体积更小，也无需无菌化处理，在很大程度上节省人力物力成本。

3、桃果实香气是桃果实品质评价的重要指标之一。己醛和反-2-己烯醛是桃果实青香型香气的重要组成物质，赋予桃新鲜、绿色和清新的气味。己醛和反-2-己烯醛属于c6醛类香气物质，来源于脂肪酸代谢途径，由脂氧合酶(lipoxygenase，lox)催化亚油酸和亚麻酸形成氢过氧化物，再由氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase，hpl)进一步催化形成。已有研究表明pphpl1参与桃果实中c6醛类物质的合成。</p>

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于诱导了多种桃果实愈伤组织，同时提供了一种发根农杆菌介导的桃果实愈伤瞬时遗传转化方法，用于基因的功能验证研究。该体系克服了在果实上进行瞬时遗传转化存在的问题，并能利用该体系实现桃基因功能的同源验证。

2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：

3、1.果实愈伤组织诱导与继代

4、材料选取：桃果实样品选自‘湖景蜜露’和‘玉露’。果实发育时期为花后30～70天。

5、无菌化处理：将果实洗净，用75％酒精消毒1min，无菌水润洗3次。2％次氯酸钠溶液浸泡果实13min，无菌水润洗5次，并用滤纸吸干表面残留液体。

6、果肉愈伤诱导：果实去皮，果肉切成约5mm*5mm大小的方块，接种于任意一种ms、sh和wpm诱导培养基中，优选为sh诱导培养基。sh诱导培养基成分包括：13.2g/l sh、20g/l蔗糖、7g/l琼脂和1g/l pvp，同时添加植物生长调节剂包括：2mg/l tdz和0.1mg/liba。

7、光照条件：将接种在诱导培养基的果肉外植体置于以下任意一种光照条件：第一种，持续在光下诱导；第二种，暗处诱导10d，转移到光下10d，再转移到暗处持续诱导；第三种，持续在暗处进行诱导。优选第二种光照条件进行果实愈伤诱导。

8、愈伤组织继代：将诱导30～40天后产生的愈伤切下，转移至sh继代培养基进行继代培养。sh继代培养基组分：13.2g/l sh、20g/l蔗糖、7g/l琼脂和1g/l pvp,同时添加植物生长调节剂包括：0.5mg/l tdz和0.5mg/l 2，4-d。

9、2.表达载体构建和发根农杆菌转化

10、使用同源重组法将目标基因构建于含有camv35s启动子的psak277过量表达载体，或使用gateway方法，将目标基因片段构建于phellsgate2(rnai)沉默表达载体。利用化学转化法，将重组载体转入msu440发根农杆菌感受态细胞。

11、基因过量表达载体构建：利用引物(seq id no.1，seq id no.2)以桃果实全长cdna为模板克隆pphpl1(seq id no.3)，使用同源重组法将pphpl1构建于含有camv35s启动子的psak277表达载体。

12、rnai沉默表达载体构建：利用引物(seq id no.4，seq id no.5)以桃果实全长cdna为模板克隆300bp的pphpl1编码序列片段(seq id no.6)，借助gateway技术，在试剂盒说明书的指导下完成一个bp反应将片段克隆到phellsgate2载体上，对测序结果进行比对获得基因沉默载体。

13、发根农杆菌转化：利用化学转化法，将上述测序正确的重组载体和用作对照的空载载体分别转入msu440发根农杆菌感受态细胞。含psak277载体和phellsgate2载体的菌株，分别在固体lb培养基1(50mg/l卡那霉素，50mg/l链霉素)和lb培养基2(50mg/l卡那霉素，12.5mg/l氯霉素)上，于28℃培养2d，挑取单克隆进行检测。

14、3.携带目标基因的发根农杆菌侵染愈伤组织

15、农杆菌准备：阳性菌株分别在含有抗生素的固体lb培养基1和2上划线，并于28℃恒温培养箱内培养2d。挑取单菌落到800μl含有抗生素的液体lb培养基中，在摇床(28℃，200rpm)上活化24h。吸取活化后的菌液20μl加入20ml含有抗生素的液体lb培养基并加入终浓度20mg/l的乙酰丁香酮，在摇床(28℃，200rpm)上摇20h。测定菌液浓度，并对菌液进行离心(4000rpm，10min)，倒弃上清液，并用sh液体培养基重悬菌液，依据之前测定的浓度，通过计算将菌液重悬到浓度为od600＝0.4，0.8，1.2，优选od600＝0.8。将重悬液放回摇床(28℃，200rpm)，摇1h，超净工作台内。sh液体培养基组分：13.2g/l sh、20g/l蔗糖、1g/l pvp、20mg/l乙酰丁香酮，ph＝5.8。

16、愈伤组织侵染：超净工作台内，准备好愈伤材料，用无菌药匙小心将愈伤拨入菌液中，浸泡时间分别为10min、20min和30min，优选10min。期间每2min上下颠倒装有愈伤组织和菌液混合物的离心管。倒计时结束后，将混合物倒在装有3层纱布的组培瓶上进行过滤，用无菌滤纸吸干愈伤表面残留的菌液。将侵染后的愈伤转移到sh固体培养基上，转移之前在固体培养基表面铺一张滤纸。sh固体培养基组分：13.2g/l sh、20g/l蔗糖、1g/lpvp、7g/l琼脂20mg/l乙酰丁香酮，ph＝5.8。

17、4.侵染后愈伤共培养及筛选

18、将侵染后的愈伤组织置于24℃黑暗条件下共培养3d。随后将共培养后的愈伤组织转移到sh筛选培养基上，24℃黑暗条件下进行筛选培养4天。sh筛选培养基组成：13.2g/lsh、20g/l蔗糖、1g/l pvp、7g/l琼脂、50mg/l卡那霉素和400mg/l头孢噻肟钠，ph＝5.8。

19、5.愈伤取样检测

20、在sh筛选培养基上筛选4d后的样品用液氮冷冻取样，并于-80℃保存。保存的样品进行rna提取，逆转录和实时荧光定量pcr检测，确认基因过量/抑制表达效果。根据基因功能开展相关表型分本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种发根农杆菌介导的桃果实愈伤瞬时遗传转化方法，其特征在于，按照以下关键步骤实现目标基因的瞬时过量表达及功能验证：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，SH诱导培养基组成：13.2g/L SH、20g/L蔗糖、7g/L琼脂和1g/L PVP，使用的植物生长调节剂包括：2mg/L TDZ和0.1mg/L IBA；SH继代培养基组分：13.2g/L SH、20g/L蔗糖、7g/L琼脂和1g/L PVP，使用的植物生长调节剂包括：0.5mg/L TDZ和0.5mg/L 2，4-D。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基因过量表达载体构建：利用序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物，以桃果实全长cDNA为模板克隆PpHPL1，使用同源重组法将PpHPL1构建于含有CaMV35S启动子的pSAK277表达载体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RNAi沉默表达载体构建：利用序列如SEQ ID NO.

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发根农杆菌转化：利用化学转化法，将测序正确的重组载体和用作对照的空载载体分别转入MSU440发根农杆菌感受态细胞，含pSAK277载体和pHELLSGATE2载体的菌株，分别在含有抗生素的固体LB培养基1和LB培养基2上，于28℃培养2天，挑取单克隆进行检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，LB培养基1含50mg/L卡那霉素，50mg/L链霉素；LB培养基2含50mg/L卡那霉素，12.5mg/L氯霉素。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，具体农杆菌准备：携带目标基因-pSAK277表达载体或pHELLSGATE2表达载体的MSU440发根农杆菌感受态细胞，分别在含有抗生素的固体LB培养基1和LB培养基2上活化，挑取单菌落到含有抗生素的液体LB培养基1和2中，28℃活化24h，吸取活化后的菌液20μL加入新的液体LB培养基，28℃培养20h，至OD600＝0.4、0.8，用SH液体培养基重悬菌液，并继续将重悬液放回摇床摇1h；具体愈伤组织侵染：将准备好的愈伤材料放入菌液中，侵染10min，侵染结束后，将混合物倒在装有多层纱布的组培瓶上进行过滤，用无菌滤纸吸干愈伤表面残留的菌液，将侵染后的愈伤转移到SH固体培养基上培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述SH液体培养基组成：13.2g/L SH、20g/L蔗糖、1g/L PVP和20mg/L乙酰丁香酮，pH＝5.8；SH固体培养基：13.2g/LSH、20g/L蔗糖、1g/L PVP、7g/L琼脂和20mg/L乙酰丁香酮，pH＝5.8。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述SH筛选培养基组成：13.2g/L SH、20g/L蔗糖、1g/L PVP、7g/L琼脂、50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢噻肟钠，pH＝5.8。

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【技术特征摘要】

1.一种发根农杆菌介导的桃果实愈伤瞬时遗传转化方法，其特征在于，按照以下关键步骤实现目标基因的瞬时过量表达及功能验证：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，sh诱导培养基组成：13.2g/l sh、20g/l蔗糖、7g/l琼脂和1g/l pvp，使用的植物生长调节剂包括：2mg/l tdz和0.1mg/l iba；sh继代培养基组分：13.2g/l sh、20g/l蔗糖、7g/l琼脂和1g/l pvp，使用的植物生长调节剂包括：0.5mg/l tdz和0.5mg/l 2，4-d。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基因过量表达载体构建：利用序列如seq id no.1、seq id no.2所示的引物，以桃果实全长cdna为模板克隆pphpl1，使用同源重组法将pphpl1构建于含有camv35s启动子的psak277表达载体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述rnai沉默表达载体构建：利用序列如seq id no.4、seq id no.5所示的引物，以桃果实全长cdna为模板克隆300bp的pphpl1编码序列片段，借助gateway技术完成一个bp反应将片段克隆到phellsgate2载体上，对测序结果进行比对获得基因沉默载体。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发根农杆菌转化：利用化学转化法，将测序正确的重组载体和用作对照的空载载体分别转入msu440发根农杆菌感受态细胞，含psak277载体和phellsgate2载体的菌株，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，李孟涛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：

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