一种干血斑采样联合LC-MS/MS技术测定咖啡因及代谢产物的方法技术

本发明专利技术属于药物检测领域，涉及一种干血斑采样联合LC

【技术实现步骤摘要】
一种干血斑采样联合LC
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MS/MS技术测定咖啡因及代谢产物的方法


[0001]本专利技术属于药物检测领域，更具体地说，涉及一种干血斑采样联合液相色谱串联质谱技术测定早产儿体内咖啡因及其主要代谢产物的分析方法。

技术介绍

[0002]咖啡因(1，3，7
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三甲基黄嘌呤)是早产儿呼吸暂停(AOP)药物治疗的首选药物，与其他生物活性甲基黄嘌呤类药物(如茶碱和氨茶碱)相比，其治疗指数更宽，耐受性更好，半衰期更长。然而，咖啡因的最佳剂量方案仍然存在争议。标准剂量方案(负荷剂量为20mg/kg柠檬酸咖啡因，然后维持剂量为5
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10mg/kg/d)被广泛使用，但在临床实践中发现咖啡因治疗反应的显著的个体间变异性。较高剂量的咖啡因似乎更有效，但仍可引起严重的不良反应，如心动过速，癫痫发作，肺水肿，代谢紊乱和小脑出血。因此，接受较高剂量咖啡因治疗的早产儿的治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring，TDM)已被2019的国家健康与护理卓越研究所指南推荐。此外，越来越多的证据表明，咖啡因的TDM对于接受较高剂量方案治疗，怀疑毒性或疗效不佳的早产儿是必要且具有成本效益的。
[0003]咖啡因在体内经CYP1A2和CYP2E1的催化可代谢为三种主要活性代谢物：可可碱(3,7
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二甲基黄嘌呤)、副黄嘌呤(1,7
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二甲基黄嘌呤)和茶碱(1,3
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二甲基黄嘌呤)。由于超过90％的咖啡因被CYP1A2代谢，咖啡因已被普遍接受为CYP1A2代谢表型的特异性探针。对于早产儿而言，CYP1A2的代谢活性随着个体发育逐渐成熟，通过代谢物的含量变化可以反应出咖啡因在患儿发育过程中的动态代谢变化。因此，同时监测咖啡因及其三种主要代谢物对于调查早产儿CYP1A2的成熟和代谢表型以及优化咖啡因的剂量方案至关重要。
[0004]因其优异的内在选择性、灵敏度和稳健性，液相色谱法与串联质谱(Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC
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MS/MS)相结合被认为是TDM的金标准。以往已经开发了几种LC
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MS/MS方法，用于同时测定人血浆或血清中的咖啡因及其主要代谢物。然而，这些方法都需要采样一定量的血液(范围从50到500μl)。由于循环血容量低，医源性贫血和输血风险增加，应避免对早产儿进行频繁或广泛的血液采样。尿液或唾液采样似乎是新生儿TDM的有希望的替代方案，但专门设计的采样装置和长采样时间限制了其临床应用。
[0005]作为常规静脉穿刺的另一个有吸引力的替代方案，干血斑(Dried blood spot，DBS)因其侵入性最小，采样量低，易于运输和储存的优点而被广泛应用于新生儿筛查和新生儿TDM。先前的几项研究报道了通过DBS采样测定咖啡因和副黄嘌呤，但红细胞压积效应，这一临床生物分析领域接受DBS分析的关键障碍，对分析的影响仍未完全解决。到目前为止还没有报道通过DBS采样同时定量咖啡因，可可碱，副黄嘌呤和茶碱的方法。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术的目的首先是提供一种干血斑采样联合液相色谱串
联质谱技术测定早产儿体内咖啡因及其主要代谢产物的分析方法；本专利技术方法具有较好的便捷性、灵敏性和稳定性，可应用于APO早产儿的临床TDM实践中。
[0007]本专利技术的另一目的是使用这种稳定准确的定量方法对AOP患儿进行治疗药物监测。
[0008]本专利技术提供的技术方案如下：
[0009]一种干血斑采样联合LC
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MS/MS技术测定咖啡因及代谢产物的方法，采用高效液相串联质谱技术检测经过前处理的干血斑样品中咖啡因及代谢产物，利用高效液相色谱将咖啡因及代谢产物与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以待测物的浓度为x轴，待测物与其内标峰面积的比值为y轴，建立标准曲线回归方程，以待测物与内标物峰面积比对标准曲线回归方程中待测物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得标准曲线回归方程计算干血斑样品中咖啡因及代谢产物的实测浓度；所述代谢产物包括副黄嘌呤、可可碱和茶碱；所述高效液相串联质谱技术的色谱条件为：采用75毫米长的C18色谱柱和5mM甲酸改性流动相梯度洗脱方法；采用含有125mM甲酸的80％甲醇溶液作为提取溶剂。
[0010]进一步的，使用10μL一次性定量毛细采血管用于制备干血斑样品，采用圆形金属打孔器将干燥后的干血斑样品冲切下来，折叠放入离心管中，在离心管中加入含125mM甲酸的80％甲醇溶液，将溶液涡旋后离心，取上清液放置于自动进样器中。
[0011]进一步的，涡旋混合和离心时间均为10分钟。
[0012]进一步的，内标工作溶液用100％甲醇稀释内标储备液配制而得；所述内标储备液为将咖啡因、咖啡因
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氘9、副黄嘌呤、副黄嘌呤
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氘3、可可碱、可可碱
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氘6、茶碱和茶碱
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氘6溶于100％甲醇中，最终制备得到5.00mg/mL的咖啡因储备液、1.00mg/mL的咖啡因
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d9储备液、0.500mg/mL的副黄嘌呤储备液、0.500mg/mL的副黄嘌呤
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氘3储备液、0.200mg/mL的可可碱储备液、0.250mg/mL的可可碱
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氘6储备液、0.500mg/mL的茶碱储备液和1.00mg/mL的茶碱
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氘6储备液。
[0013]进一步的，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为含5mM甲酸的水溶液；流动相B为含5mM甲酸的甲醇溶液。
[0014]进一步的，梯度洗脱程序如下：
[0015][0016]进一步的，离子化模式采用电喷雾电离，正离子模式和多重反应监测。
[0017]进一步的，咖啡因的碰撞能量采用13V，副黄嘌呤的碰撞能量采用26V，可可碱的碰撞能量采用25V，茶碱的碰撞能量采用26V；咖啡因
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d9的碰撞能量采用29V，副黄嘌呤
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d3的碰撞能量采用28V，可可碱
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d6的碰撞能量采用27V，茶碱的碰撞能量采用27V。
[0018]进一步的，分析/洗脱色谱柱为C18 75
×
4.6mm,i.d.,3.5μm,Waters；柱温为35℃；自动进样器温度为4℃；进样体积为10.00μL。
[0019]进一步的，标准曲线参数如下所示：
[0020][0021][0022]有益效果
[0023]本专利技术提供一种LC
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MS/MS方法，通过DBS采样同时定量咖啡因及其三种主要代谢物。在方法开发和验证过程中，我们应用了几个关键技术来开发本方法。
[0024](1)双定量采样技术准确采样
[0025]首先，目前已经认识到DBS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干血斑采样联合LC
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MS/MS技术测定咖啡因及代谢产物的方法，其特征在于，采用高效液相串联质谱技术检测经过前处理的干血斑样品中咖啡因及代谢产物，利用高效液相色谱将咖啡因及代谢产物与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以待测物的浓度为x轴，待测物与其内标峰面积的比值为y轴，建立标准曲线回归方程，以待测物与内标物峰面积比对标准曲线回归方程中待测物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得标准曲线回归方程计算干血斑样品中咖啡因及代谢产物的实测浓度；所述代谢产物包括副黄嘌呤、可可碱和茶碱；所述高效液相串联质谱技术的色谱条件为：采用75毫米长的C18色谱柱和5mM甲酸改性流动相梯度洗脱方法；采用含有125mM甲酸的80％甲醇溶液作为提取溶剂。2.根据权利要求1所述的干血斑采样联合LC
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MS/MS技术测定咖啡因及代谢产物的方法，其特征在于，使用10μL一次性定量毛细采血管用于制备干血斑样品，采用圆形金属打孔器将干燥后的干血斑样品冲切下来，折叠放入离心管中，在离心管中加入含125mM甲酸的80％甲醇溶液，将溶液涡旋后离心，取上清液放置于自动进样器中。3.根据权利要求2所述的干血斑采样联合LC
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MS/MS技术测定咖啡因及代谢产物的方法，其特征在于，涡旋混合和离心时间均为10分钟。4.根据权利要求1所述的干血斑采样联合LC
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MS/MS技术测定咖啡因及代谢产物的方法，其特征在于，内标工作溶液用100％甲醇稀释内标储备液配制而得；所述内标储备液为将咖啡因、咖啡因
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氘9、副黄嘌呤、副黄嘌呤
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氘3、可可碱、可可碱
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氘6、茶碱和茶碱
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氘6溶于100％甲醇中，最终制备得到5.00mg/mL的咖啡因储备液、1.00mg/mL的咖啡因
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氘9储备液、0.500mg/mL的副黄嘌呤储备液、0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈峰，胡雅慧，郭宏丽，代浩然，章媛媛，王洁，许静，程锐，
申请(专利权)人：南京市儿童医院，
类型：发明
国别省市：