一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系和培养方法技术

本申请涉及一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系和培养方法。所述体外简易培养体系包括激活培养液、活化培养液、扩增培养液1和扩增培养液2；所述激活培养液为包含140~180ug/mL抗

【技术实现步骤摘要】
IL
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18、5～15ng/mL IL
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1α、800～1200IU/mL IL
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2、30～80ng/mL PHA和1～5v/v％人血小板裂解物的基础培养液。
[0007]本申请所述激活培养液中的抗
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CD16
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单克隆抗体能够结合NK细胞表面的CD16位点，增强细胞因子(如IL
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2、IL
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15和IL
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21)对NK细胞的刺激，以及ADCC对肿瘤细胞的杀伤作用，进而诱导NK细胞活化，提高NK细胞的扩增效率，并获得更高纯度的NK细胞。抗
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Her2
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单克隆抗体能够特异性识别Her2蛋白受体，抑制其介导的信号转导，是ADCC的潜在介质，在NK细胞增殖和功能调节中具有重要作用，能够有效刺激NK细胞使细胞激活。层粘连蛋白分子量为805kD，由一个400kD的α链和两条200kD左右的β链组成，是细胞外间质中的一种非胶原性结构蛋白，为细胞黏着于基质的介质。本申请人的专利技术人创造性的发现，层粘连蛋白能够提升抗
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Her2
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单克隆抗体对NK细胞的体外激活作用，提高抗
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Her2
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单克隆抗体的诱导活性，二者协同使用能够显著提升诱导效果并提升细胞的增殖能力。人血小板裂解物含有细胞生长所需的所有生长因子和蛋白质，能够为细胞的生长提供营养物质，进而提高细胞的增殖能力。
[0008]本申请所述活化培养液中的细胞因子(IL
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15、IL
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21、IL
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18、IL
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1α、IL
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2)能够刺激NK细胞使其大量扩增，促进NK细胞的大量增殖，并且提高其细胞的杀伤活性。PHA(植物血凝素)是一种有丝分裂原，主要用于激活淋巴细胞，刺激机体产生IL
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2和干扰素，进而有效刺激NK细胞的增殖。同时人血小板裂解物同样用于为NK细胞的生长提供营养物质，进而提高细胞的增殖能力。
[0009]本申请通过采用上述组成的激活培养液，在不需要对培养瓶进行提前包被的情况下，能够有效对接种的脐带血单个核细胞进行刺激和激活，使其快速适应体外培养坏境，进而提高NK细胞的增殖能力。同时上述组成的激活培养液与在上述组成的活化培养液存在协同复合效果，通过在细胞的不同培养阶段添加所述激活培养液和活化培养液，在二者的共同配合下，提升了对NK细胞的诱导效果，促进NK细胞的大量增殖，培养产物中流式指标的纯度高，并且提高其细胞的杀伤活性。
[0010]本申请中的人血小板裂解物为市售产品，本领域技术人员可根据需要采购使用。
[0011]在一些优选的实施方式中，所述激活培养液中抗
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Her2
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单克隆抗体的含量为150～170ug/mL，抗
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CD16
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单克隆抗体的含量为0.6～0.7ug/mL，层粘连蛋白的含量为15～25ug/mL，人血小板裂解物的含量为2～3v/v％。
[0012]本申请通过进一步将激活培养液中的各组分的含量控制在上述范围内，能够使所述激活培养液的效果更佳，进而进一步提高了NK细胞的增殖能力和细胞杀伤活性。
[0013]在一些实施方式中，所述激活培养液中抗
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Her2
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单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为(5～10):1。在一些优选的实施方式中，所述激活培养液中抗
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Her2
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单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为8:1。
[0014]本申请通过将激活培养液中抗
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Her2
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单克隆抗体与层粘连蛋白的用量关系控制在上述范围内，能够更好地发挥二者之间的协同作用，进一步提升NK细胞的诱导效果并提升NK细胞的增殖能力。
[0015]在一些实施方式中，所述活化培养液中还包含20～50ng/mL的维生素C磷酸酯钠。
[0016]本申请中，维生素C磷酸酯钠是一种维生素C衍生物，有抗氧化活性，可以促进细胞的生长、增殖，提高细胞存活率。本申请的专利技术人通过研究发现，当在活化培养液中进一步
添加维生素C磷酸酯钠后，维生素C磷酸酯钠与PHA之间存在协同作用，进而使NK细胞的增殖能力更佳。
[0017]在一些实施方式中，所述活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为(1～3):1。在一些优选的实施方式中，所述活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的质量比为2:1。
[0018]本申请通过将活化培养液中PHA与维生素C磷酸酯钠的用量关系控制在上述范围内，能够更好地发挥二者之间的协同作用，进一步提升NK细胞的增殖能力和细胞杀伤活性。
[0019]在一些实施方式中，所述扩增培养液1为包含800～1200IU/mL IL
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2和1～5v/v％人血小板裂解物的基础培养液；所述扩增培养液2为包含800～1200IU/mL IL
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2的基础培养液。
[0020]本申请所述扩增培养液1和扩增培养液2中均含有对NK细胞刺激作用的IL
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2，通过采用上述组成的扩增培养液1和扩增培养液2能够有效对NK细胞进行增殖，实现细胞的大量体外增殖。
[0021]本申请对所述激活培养液、活化培养液、扩增培养液1和扩增培养液2中的基础培养基没有明确限定，本领域中细胞培养时采用的常规基础培养基均可以使用，成本低廉。例如，所述基础培养基可以为IMDM培养基、EMDM培养基、DMDM培养基、RPMI1640培养基、KBM 581培养基或KBM 551培养基等。值得注意的是，本申请中采用的基础培养基中均不含有动物源血清，有效降低了临床使用风险。
[0022]本申请第二方面提供了一种采用如本申请第一方面所述的体外简易培养体系对脐带血来源NK细胞进行培养的方法，所述方法包括如下步骤：S1，将分离的脐带血单个核细胞与所述激活培养液混合后的细胞混合液接种于未经包被的培养瓶中，培养2～3天，获得第一培养物；S2，将所述第一培养物与所述活化培养液混合后培养2～3天，获得第二培养物；S3，将所述第二培养物与所述扩增培养液1混合后培养4～6天，获得第三培养物；S4，将所述第三培养物与所述扩增培养液2混合后培养8～10天，获得第四培养物；S5，收集第四培养物中的NK细胞。
[0023]本申请所述方法通过在细胞培养的不同阶段添加所述体外简易培养体系中相应的培养液，能够有效对NK细胞进行诱导和增殖，培养过程简单、细胞培养效率高且扩增倍数高，同时NK细胞培养产物中流式指标的纯度高，且NK细胞的细胞杀伤活性优异。将细胞产品赋予了“off the shelf”的特点，为临床上细胞申请和应用的简化了步骤、缩短了时间，为细胞治疗产品化和产业化提供了可行性的条件本申请中，所述培养过程的培养条件为细胞培养的常规条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐带血来源NK细胞的体外简易培养体系，其特征在于，所述体外简易培养体系包括激活培养液、活化培养液、扩增培养液1和扩增培养液2；所述激活培养液为包含140~180ug/mL抗
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Her2
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单克隆抗体、0.5~0.8ug/mL抗
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CD16
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单克隆抗体、10~30ug/mL层粘连蛋白和1~5v/v%人血小板裂解物的基础培养液；所述活化培养液为包含30~80ng/mL IL
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15、5~15ng/mL IL
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21、10~50ng/mL IL
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18、5~15ng/mL IL
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1α、800~1200IU/mL IL
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2、30~80ng/mL PHA和1~5v/v%人血小板裂解物的基础培养液。2.根据权利要求1所述的体外简易培养体系，其特征在于，所述激活培养液中抗
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Her2
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单克隆抗体的含量为150~170ug/mL，抗
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CD16
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单克隆抗体的含量为0.6~0.7ug/mL，层粘连蛋白的含量为15~25ug/mL，人血小板裂解物的含量为2~3v/v%。3.根据权利要求2所述的体外简易培养体系，其特征在于，所述激活培养液中抗
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Her2
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单克隆抗体与层粘连蛋白的质量比为（5~10）:1。4.根据权利要求1
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3中任意一项所述的体外简易培养体系，其特征在于，所述活化培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：马奎，薛光耀，李江涛，高超，
申请(专利权)人：河北生命原点生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：