一种脐带干细胞用冻存保护液及制备方法和应用技术

本申请涉及冻存保护液技术领域，具体公开了一种脐带干细胞用冻存保护液及制备方法和应用。脐带干细胞用冻存保护液主要由以下重量百分数的原料制成：膦酰二肽钠3

【技术实现步骤摘要】
一种脐带干细胞用冻存保护液及制备方法和应用


[0001]本申请涉及冻存保护液
，更具体地说，它涉及一种脐带干细胞用冻存保护液及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]超低温冻存是将生物样本放置在液氮中，形成冻存生物样本。此时，生物样本的新陈代谢基本停止，而细胞活性和功能潜力被保留下来，表现为“休眠”或“假死”的状态。待需要使用时，将冻存生物样本复温至37℃，生物样本也恢复细胞功能。虽然超低温冻存能够长期、稳定的保存细胞，但是在降温过程中，细胞内外不可避免的会产生冰晶，冰晶的形成和生长对细胞具有一定的机械损伤，甚至损坏细胞功能，造成细胞死亡。
[0003]为了降低细胞于降温过程中的损伤，大部分研究者在冻存保护液中加入二甲基亚砜，但是二甲基亚砜为有毒有机溶剂，不仅影响酶功能，干扰细胞代谢活动，而且复温后，需要经过多步洗脱以除去二甲基亚砜。在洗脱过程中不可避免的会产生细胞内外渗透压突变，进而可能也会造成细胞损伤，严重时出现细胞死亡。还有少部分研究者在冻存保护液中加入丙三醇，但是丙三醇对细胞的渗透性差、生物相容性差，而且复温后，也需要经过多步洗脱以除去丙三醇，此时基于丙三醇的渗透速率缓慢，容易造成细胞过度吸水而涨破死亡。

技术实现思路

[0004]为了解决上述缺陷，本申请提供一种脐带干细胞用冻存保护液及制备方法和应用。
[0005]第一方面，本申请提供一种脐带干细胞用冻存保护液，采用如下的技术方案：一种脐带干细胞用冻存保护液，其主要由以下重量百分数的原料制成：膦酰二肽钠3
‑r/>5％、脯氨酸3
‑
5％、磷脂酰胆碱1
‑
3％、两性甲基丙烯酸酯聚合物1
‑
3％、葡聚糖0.5
‑
1.5％、人血白蛋白5
‑
7％，余量为磷酸盐缓冲液。
[0006]冻存保护液应用于脐带干细胞的冻存处理，保存6个月复温后细胞存活率＞89％，具有较高的复温细胞存活率，降低脐带干细胞在降温
‑
复温过程中的损伤。使冻存脐带干细胞复温后，能够有效的恢复活性和功能，表现出较高的复苏性。
[0007]脯氨酸为细胞所需氨基酸，可以通过载体主动输送到细胞内，但是载体数量有限，能耗多。膦酰二肽钠为一种二肽盐，也能够主动输送到细胞内，能耗低，转运速度更快，也不容易饱和。磷脂酰胆碱为细胞膜的组成成分。在冻存保护液中同时加入膦酰二肽钠、氨基酸、磷脂酰胆碱，且通过其之间的相互配合，能够渗透入细胞内，然后和细胞内的水分子结合，破坏水分子之间的氢键，降低冰点，减少水分子聚集而形成冰晶，也降低冰晶的生长，降低电解质溶度，提高复温后细胞存活率。由于磷脂酰胆碱具有磷酸基团和季胺基团，表现出两性，其还能够和电解质进行结合，进一步降低电解质浓度，降低细胞冻存损伤，提高冻存保护液的使用效果。
[0008]两性甲基丙烯酸酯聚合物、葡聚糖均为高分子物质。在冻存保护液中同时加入两
性甲基丙烯酸酯聚合物、葡聚糖，均无法渗透入细胞内，且通过其之间的相互配合，能够和细胞外的水分子结合，也能够降低冰点，减少细胞外冰晶的形成和生长，维持细胞内外渗透压的平衡，降低细胞于降温
‑
复温过程中的死亡率。由于两性甲基丙烯酸酯聚合物中具有阳离子基团和阴离子基团，也表现出两性，增强其和水分子、电解质的结合能力，也提高冻存保护液的使用效果。人血白蛋白能够为细胞提供营养，生长因子，便于细胞的复苏的生长，而且人血白蛋白也无法渗入细胞内，也能够和水分子结合，降低细胞冻存的损伤。
[0009]本申请的冻存保护液，通过膦酰二肽钠、氨基酸、磷脂酰胆碱之间的协同增效，结合两性甲基丙烯酸酯聚合物、葡聚糖之间的相互配合，还能够有效的调节细胞内外的渗透压，降低细胞脱水或涨破的情况。再结合人血白蛋白，便于细胞的复苏，提高复温后细胞存活率。
[0010]同时，本申请的冻存保护液，不仅提高复温后细胞存活率。而且由于不含二甲基亚砜、丙三醇，且基于膦酰二肽钠、氨基酸、磷脂酰胆碱具有良好的生物相容性，两性甲基丙烯酸酯聚合物、葡聚糖、人血白蛋白无法渗入细胞内。复温后可以过滤、配制注射液，然后注入机体内，也可以复温后稀释、配制注射液，然后注入机体内。本申请的冻存保护液，复温后不需要经过洗脱步骤，操作简单，也降低因操作繁琐而可能引入污染的风险。
[0011]可选的，其主要由以下重量百分数的原料制成：膦酰二肽钠4％、脯氨酸4％、磷脂酰胆碱2％、两性甲基丙烯酸酯聚合物2％、葡聚糖1％、人血白蛋白6％，余量为磷酸盐缓冲液。
[0012]通过采用上述技术方案，对冻存保护液的原料配比进行优化，提高复温后细胞存活率。
[0013]可选的，所述两性甲基丙烯酸酯聚合物采用以下方法制备：Sa、在惰性气体保护、不断搅拌下，于丙酮中加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，搅拌且混合均匀，然后加入1,3
‑
丙醇酸内酯，搅拌处理7
‑
9h，过滤，洗涤，获得羧酸聚合单体；Sb、在惰性气体保护、温度为70
‑
80℃、不断搅拌下，于水中加入羧酸聚合单体、甲基丙烯酸二甲基丙基磺酸胺乙酯，搅拌且混合均匀，然后加入引发剂，搅拌处理25
‑
35h，采用透析袋过滤，冷冻干燥，获得两性甲基丙烯酸酯聚合物。
[0014]可选的，所述甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、1,3
‑
丙醇酸内酯、甲基丙烯酸二甲基丙基磺酸胺乙酯、引发剂的重量配比为1:(0.4
‑
0.6):(1
‑
2):(0.01
‑
0.03)。
[0015]通过采用上述技术方案，首先通过甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和1,3
‑
丙醇酸内酯反应形成带有羧基的聚合单体，然后将羧酸聚合单体、甲基丙烯酸二甲基丙基磺酸胺乙酯反应形成高分子聚合物，此时，高分子聚合物中含有羧酸基团、磺酸基团、季胺基团，能够有效的恢复细胞复温后的功能和形态，提高复温后细胞存活率。
[0016]可选的，所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠中的一种或几种。
[0017]通过采用上述技术方案，对引发剂进行优化，不仅引发羧酸聚合单体、甲基丙烯酸二甲基丙基磺酸胺乙酯发生聚合反应，而且后续采用透析袋进行过滤，便于除去引发剂，提高两性甲基丙烯酸酯聚合物的纯度，降低两性甲基丙烯酸酯聚合物将引发剂带入冻存保护液中，而影响细胞存活率。
[0018]进一步的，两性甲基丙烯酸酯聚合物制备方法中，丙酮、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的重量配比为(5
‑
15):1。水、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的重量配比为(5
‑
15):1。
[0019]可选的，所述葡聚糖为右旋糖酐40，所述磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液。
[0020]通过采用上述技术方案，对葡聚糖、磷酸盐缓冲液进行优化，便于原料的选择和制备。
[0021]第二方面，本申请提供一种上述所述的脐带干细胞用冻存保护液的制备方法，采用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐带干细胞用冻存保护液，其特征在于：其主要由以下重量百分数的原料制成：膦酰二肽钠3
‑
5%、脯氨酸3
‑
5%、磷脂酰胆碱1
‑
3%、两性甲基丙烯酸酯聚合物1
‑
3%、葡聚糖0.5
‑
1.5%、人血白蛋白5
‑
7%，余量为磷酸盐缓冲液。2.根据权利要求1所述的一种脐带干细胞用冻存保护液，其特征在于：其主要由以下重量百分数的原料制成：膦酰二肽钠4%、脯氨酸4%、磷脂酰胆碱2%、两性甲基丙烯酸酯聚合物2%、葡聚糖1%、人血白蛋白6%，余量为磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的一种脐带干细胞用冻存保护液，其特征在于：所述两性甲基丙烯酸酯聚合物采用以下方法制备：Sa、在惰性气体保护、不断搅拌下，于丙酮中加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，搅拌且混合均匀，然后加入1,3
‑
丙醇酸内酯，搅拌处理7
‑
9h，过滤，洗涤，获得羧酸聚合单体；Sb、在惰性气体保护、温度为70
‑
80℃、不断搅拌下，于水中加入羧酸聚合单体、甲基丙烯酸二甲基丙基磺酸胺乙酯，搅拌且混合均匀，然后加入引发剂，搅拌处理25
‑
35h，采用透析袋过滤，冷冻干燥，获得两性甲基丙烯酸酯聚合物。4.根据权利要求3所述的一种脐带干细胞用冻存保护液，其特征在于：所述甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、1,3
‑
丙醇酸内酯、甲基丙烯酸二甲基丙基磺酸胺乙酯、引发剂的重量配比为1:(0.4
‑
0.6):(1
‑
2):(0.01
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：马奎，高超，李江涛，薛光耀，
申请(专利权)人：河北生命原点生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：