一种丝状真菌高通量培养方法技术

本发明专利技术公开了一种丝状真菌高通量培养方法，属于微生物技术领域。本发明专利技术通过粘贴透气密封膜实现孔板制种，提高制种培养通量，通过振荡洗脱方式简化孢子获取步骤，提高孢子悬液制备通量，通过改进振幅和转速，解决丝状真菌孔板培养时菌液不均一平行性差的问题，将丝状真菌的制种和液体培养通量增加24倍及以上，综合而言培养效率能提升数百倍。本发明专利技术为丝状真菌的高通量培养提供一种新型有效的方法。菌的高通量培养提供一种新型有效的方法。菌的高通量培养提供一种新型有效的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种丝状真菌高通量培养方法


[0001]本专利技术属于为微生物
更具体的说，本专利技术涉及一种丝状真菌的高通量培养方法。

技术介绍

[0002]丝状真菌又称“霉菌”，是依附于有机物生长的一种具有发达菌丝体的异养真核生物，广泛分布于土壤，水体等几乎所有已知环境中，其生物总量巨大。与常用的单细胞、原核微生物大肠杆菌、芽孢杆菌或真核细胞酿酒酵母、毕赤酵母相比，丝状真菌在工业生产中具有原料要求低、高表达、高分泌、翻译后加工等优势。因此，丝状真菌在发酵食品和次级代谢物生产中有重要应用，例如蛋白、抗生素、脂质、色素、有机酸等物质。
[0003]丝状真菌作为一类重要的工业发酵生产宿主菌，如何进行高通量无菌培养和高效检测筛选性能优异的菌株是丝状真菌研究的重要方向。无论是通过传统诱变方式，还是通过基因编辑技术都能产生大量突变体，但如何针对这些产生的大量具有不同性状、不同基因型或表型的菌株进行高通量培养用于后续的检测筛选仍未解决。
[0004]目前丝状真菌依然是采用传统的平皿方式进行培养制种，采用从平皿上刮取后过滤的方式进行孢子制备，采用摇瓶的方式进行菌株发酵培养，存在制种费时费力、通量低、孢子悬液制备步骤繁琐等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种丝状真菌高通量培养方法。
[0006]首先，本专利技术通过粘贴透气密封膜实现孔板制种，提高制种培养通量；其次，通过摇动洗脱方式，将制备孢子悬液时繁琐的平皿刮洗、过滤多个步骤变为简便的单一步骤，提高孢子悬液制备通量，且单位面积孢子产孢能力得到提高；最后，通过改进培养装置的振幅和转速参数，解决孔板培养丝状真菌时不均一的问题。
[0007]更具体地，包括如下步骤：
[0008](1)在含有固体培养基的孔板内进行菌株制种培养；
[0009](2)在含有孢子的第(1)步获得的孔板内加入溶液，通过振荡方式获得孢子悬液；
[0010](3)吸取第(2)步中的孢子悬液，转接至含有液体培养基的孔板内，进行菌株发酵培养；
[0011](4)收集第(3)步中的菌株发酵液，进行发酵产物检测。
[0012]其中，所述第(1)步中的孔板为6
‑
96孔，优选为24孔板。
[0013]优选地，所述第(1)步中的孔板培养时粘贴封口膜避免孢子飞散。
[0014]优选地，所述第(1)步中的封口膜为透气封口膜，优选为纸质透气封口膜。
[0015]优选地，所述第(2)步中添加的溶液可以为任何所需液体，优选为无菌水。
[0016]优选地，所述第(2)步中在孔板内添加和吸取溶液时，应覆盖阻挡垫避免孢子飞散，优选为带有切口的硅胶垫，优选地，阻挡垫是带有对应每个孔有切口的硅胶垫，且硅胶
垫凸起面远离封口膜；更优选地，所述切口是对角切口。
[0017]另外，优选地硅胶垫放置在固定盖内固定，既防止硅胶垫移动，又方便硅胶垫的拿取操作，进一步优选地所述固定盖为可灭菌耐用的金属盖。
[0018]优选地，所述第(2)步中的硅胶垫放置在金属盖内，既能防止硅胶垫移动，又能方便硅胶垫的拿取操作。
[0019]优选地，所述第(2)步中孢子悬液获得方式为振荡，优选为涡旋振荡，进一步地可简化为手动振荡。
[0020]优选地，所述第(2)步振荡孔板前可以取下阻挡垫，并粘贴封口膜避免液体串扰污染。
[0021]优选地，所述第(3)步的孔板培养时转速为700
‑
1200r/min，优选为振幅3mm转速1000
‑
1200r/min，进一步优选为振幅5mm转速700
‑
800r/min。
[0022]本专利技术的积极效果在于：通过孔板制种、孔板内的孢子悬液制备、孔板培养参数改进，创新获得一种丝状真菌高通量培养方法，将丝状真菌的制种通量提高24倍，单位面积产孢子能力提高350％，孢子悬液制备和菌株培养的通量提高6
‑
24倍或倍比递增，培养效率综合提高数百倍。本专利技术对于丝状真菌的高通量培养和菌株改造选育具有重要意义。
附图说明
[0023]图1不同制种方式的孢子生长状态比较。
[0024]图2不同制种方式的产孢子能力比较。
[0025]图3不同方式制备孢子悬液的效果比较。
[0026]图4不同处理方式制备的孢子悬液的得率和孢子萌发率比较。
[0027]图5硅胶垫(A)和金属固定盖(B)实物图，其中a局部放大图。
[0028]图6不同转速下的孔内溶液串扰污染测试。
[0029]图7采用试管和24孔板并使用普通摇床培养丝状真菌的菌液状态。
[0030]图8采用24孔板并使用高速摇床在不同振幅和转速下培养丝状真菌的菌液状态。
[0031]图9采用6孔板和摇瓶并使用普通摇床培养丝状真菌的产物产量比较。
[0032]图10采用6孔板培养丝状真菌的菌液状态和均一度情况。
具体实施方式
[0033]本专利技术的以下实施例和附图仅说明实现本专利技术的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本专利技术的限制，它完全可以被适用于各种适合本专利技术的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此，任何在不脱离本专利技术的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本专利技术的保护范围之内。
[0034]本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
[0035]下面结合附图对本专利技术做进一步详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0036]实施例中用到的培养基配方
[0037]液体培养基(1L)：50
×
Vogel
’
s盐20mL，蔗糖20g，组氨酸(50mg/mL)20mL。
和9.6
×
107个。该结果显示三种培养方式中24孔板效果最好，其产孢子能力和孢子总量均最高。平皿培养的单位面积产孢子能力仅约为试管培养的33％，而24孔板的培养方式单位培养面积产孢子能力相比较于平皿方式提高350％，培养通量提高24倍。因此，利用24孔板培养的方式不仅大幅提高单位面积的产孢子能力，还有效提高制种通量，在菌株改造过程中有效增加菌株检测筛选效率，减少耗材成本和工作强度。
[0050](4)不同方式制备孢子悬液效果的测试比较
[0051]为确保丝状真菌液体发酵结果的平行性好、可重复，需要将孢子洗脱制备成孢子悬液后，再定量加入液体培养基进行发酵培养。参见前述制种方法制备孢子悬液。由于传统平皿培养的孢子需要吹、洗、刮板等过程制备孢子悬液，虽然孢子得率约107个/mL，但所得孢子悬液中除了孢子外还含有大量菌丝物质(图3)，因此孢子悬液需要经无菌擦镜纸后过滤后才能使用，存在步骤多、效率低的问题。虽然超声能同时对多个容器内的孢子进行操作，但孢子得率较低本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丝状真菌高通量培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将丝状真菌接种至含有固体培养基的孔板内，静置进行菌株制种培养；S2：在培养后的孔板内加入溶液，通过振荡获得孢子悬液；S3：将获得的孢子悬液转接至含有液体培养基的孔板内，振荡培养获得菌株发酵液，用于产物检测和菌株检测或筛选；其中，步骤S1中培养时孔板上粘贴封口膜避免孢子飞散；步骤S2加入溶液时在孔板上覆盖阻挡垫避免孢子飞散。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1的封口膜为透气封口膜。3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1的封口膜为纸质透气封口膜。4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1的孔板为6
‑
96孔，优选为6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板。5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2覆盖的阻挡垫是带有对应每个孔有切口的硅胶垫，且硅胶垫凸起面远离封口膜；优选地硅胶垫放置在固定...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂然，张永利，田朝光，
申请(专利权)人：重庆工商大学，
类型：发明
国别省市：