一种抗丙草胺的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗丙草胺的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C20222365的杂交瘤细胞PR

【技术实现步骤摘要】
一种抗丙草胺的单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种抗丙草胺的单克隆抗体，本专利技术还涉及该单克隆抗体在检测丙草胺中的应用以及一种检测丙草胺的酶联免疫方法。

技术介绍

[0002]丙草胺是一种高效、低毒、广谱的播后苗前选择性氯乙酰胺类除草剂，在移栽稻田中被广泛使用，主要用于水稻田的杂草防除。由于丙草胺化学结构稳定，水溶性强，易通过入渗进入水土，造成地表水和土壤污染，丙草胺在杀灭大量杂草、提高作物产量的同时，也暴露出了过量使用潜在的问题。如杂草对除草剂的抗性增强，农田和周围生态环境被污染，丙草胺再通过食物链的富集作用等，严重威胁生态环境安全。丙草胺在大鼠体内经代谢可产生具致癌作用的二烷基醌亚胺，使大鼠鼻癌、胃癌与肝癌发生率提高，故将其列为可能对人体致癌的化合物。丙草胺还会破坏鱼种的鳃和肝脏在内的多种器官，对鱼类毒性较大，毒性作用表现为鳃粘连、出血、充血、增生和细胞坏死，会对渔业生产和生态环境造成不良影响。环境中的丙草胺再通过食物链的富集作用，最终将进入人体危害人体健康，有体内外研究表明，长期接触丙草胺可导致神经毒性、遗传毒性和致癌性现象的出现。
[0003]因此，在保证社会生产和人类生存的同时必须重视对丙草胺的残留检测。我国食品安全国家规定标准GB2763
‑
2021《食品中农药最大残留限量》中规定丙草胺最大残留限量(MRL)小麦中为0.05mg/kg，大米中为0.10mg/kg，茭白为0.10mg/kg。目前国内外丙草胺的残留分析方法主要是液相色谱、气相色谱法和气质联用法，尽管仪器分析方法的检测限可达0.001
‑
0.01mg/kg，但检测成本高，耗费时间长，不适合批量样品的快速检出，而酶联免疫检测方法(ELISA)具有简单、快速、高效等优点，非常适合复杂基质中痕量组分的分析。
[0004]氯乙酰胺类除草剂的分子结构上有多个可被取代的基团，常见的有苯环上的取代、氯乙酰基团上的取代以及烷基醚结构上的取代，这些取代部位为合成不同的抗原创造了有利条件，并可利用不同的抗原制备抗体以实现对乙酰胺类除草剂的检测。例如，CN112485430A公开了一种将甲草胺与氯甲基甲基醚反应后得到的半抗原，该半抗原是在甲草胺的苯环上取代了丙醛，利用该半抗原得到的单抗对甲草胺、乙草胺和丙草胺具有较高的交叉反应率，可用于三种除草剂的检测，其中对甲草胺的IC
50
为0.1
‑
0.6μg/L。又如，CN 106995800 A公开了一种将乙草胺与3
‑
巯基丙酸反应后合成的半抗原，该半抗原是将乙草胺上的氯乙酰基团取代为巯基丙酸，免疫动物得到的单抗可识别甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺四种除草剂，特异性较差，其中对丙草胺的IC
50
为10ng/mL。
[0005]在上述背景下，申请人通过对氯乙酰胺类除草剂的化合物种类以及取代基进行大量研究和筛选，最终得到一种以丙草胺与3
‑
巯基丙酸为起始原料合成的半抗原，并利用该半抗原随机筛选出一种特异性抗丙草胺的单克隆抗体，与现有技术相比，本专利技术在检测种类的特异性方面具有明显优势，能够从众多的氯乙酰胺类除草剂中特异性识别丙草胺。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的在于提供一种抗丙草胺的单克隆抗体，能特异性识别丙草胺。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供一种杂交瘤细胞株，能产生特异性识别丙草胺的单克隆抗体。
[0008]本专利技术的第三个目的在于提供所述单克隆抗体在制备检测丙草胺的试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术的第四个目的在于提供包含所述单克隆抗体的试剂盒。
[0010]本专利技术的第五个目的在于提供一种检测丙草胺的酶联免疫方法，该方法不仅实现了丙草胺的特异性检测，而且还具有很高的检测灵敏性。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0012]首先，本专利技术合成了一种丙草胺半抗原，该半抗原是以丙草胺为起始原料，将其氯乙酰基团取代为巯基丙酸，半抗原结构式如下：
[0013][0014]将以上半抗原与载体蛋白偶联，分别得到免疫原和包被原。
[0015]所述的载体蛋白可以是牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，但不局限于这两种蛋白。
[0016]利用免疫原免疫小鼠，对小鼠脾脏进行细胞融合，然后经过亚克隆筛选得到杂交瘤细胞，再采用体内诱生腹水法获得抗丙草胺的单克隆抗体。
[0017]将其中一株杂交瘤细胞命名为PR
‑
114，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C20222365。
[0018]该杂交瘤细胞PR
‑
114分泌的单克隆抗体能特异性识别丙草胺，对其它氯乙酰胺类除草剂没有交叉反应，且该单克隆抗体对丙草胺有很强的识别能力(IC
50
值很低)。
[0019]进一步地，本专利技术还利用该单克隆抗体开发了检测丙草胺的试剂盒和一种酶联免疫方法。
[0020]所述的试剂盒是用于检测丙草胺的酶联免疫试剂盒，其中包含以上所述的单克隆抗体。
[0021]所述的酶联免疫方法可用于检测丙草胺，包括环境土壤、水质以及大米的丙草胺。所述方法包括以下步骤：
[0022](1)将半抗原与载体蛋白偶联得到包被原；
[0023](2)将包被原稀释后包被固相载体；
[0024](3)利用保藏号为CCTCC NO:C20222365的杂交瘤细胞PR
‑
114制备单克隆抗体；
[0025](4)将单克隆抗体稀释后配制成抗体工作液；
[0026](5)向固相载体中加入待测样品溶液和抗体工作液并进行孵育；
[0027](6)接着加入酶标二抗进行孵育；
[0028](7)加入底物液和终止液，用酶标仪测定OD值并计算含量。
[0029]其中，所述包被原稀释后的浓度为0.0625μg/mL。
[0030]所述抗体工作液的浓度为1μg/mL。
[0031]所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
[0032]该方法具有很高的检测准确性和灵敏度，检测范围可达0.0625～1ng/mL，方法的IC
50
为0.315ng/mL。
[0033]本专利技术的有益效果是：
[0034]本专利技术提供的抗体和检测方法具有灵敏度高、特异性强的优点，能更好地应用于丙草胺及其残留检测，防止农药进入人体产生安全危害。本专利技术还具有检测效率高，操作简便快速等优点，适用于大量样本的现场快速检测。
附图说明
[0035]图1为间接竞争酶联免疫方法(ic
‑
ELISA)检测丙草胺的标准抑制曲线。X轴为丙草胺标准溶液浓度，Y轴为标准品溶液的光密度值除以空白孔的光密度值(B/B0)。
具体实施方式
[0036]下面通过具体实施例对本专利技术进行说明，但本专利技术并不局限于此，凡在本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞PR
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114，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C20222365。2.一种单克隆抗体，它由权利要求1所述的杂交瘤细胞PR
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114所分泌。3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备丙草胺检测试剂盒中的应用。4.包含权利要求2所述单克隆抗体的试剂盒。5.如权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测丙草胺的酶联免疫试剂盒。6.一种非诊断目的检测丙草胺的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将半抗原与载体蛋白偶联得到包被原；(2)将包被原稀释后包被固相载体；(3)利用保藏号为CCTCC NO:C2022236...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭大鹏，陈建军，殷晓阳，范小慧，任万强，
申请(专利权)人：武汉上成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：