一种布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于制备单克隆抗体的杂交瘤细胞株LPS

【技术实现步骤摘要】
一种布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用


[0001]本专利技术属于人和动物疫病检测
，具体涉及一种布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病(以下简称布病)是一种由布鲁氏菌引起的重要的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，《中华人民共和国传染病防治法》规定其为乙类传染病，该病对我国养殖业、食品安全与人类健康构成重大威胁。根据公开发表的数据，我国各省(自治区、直辖市)均有畜间布病的报道，但北方省份的阳性率较高，南方省份的阳性率相对较低。近几年，随着养殖规模的扩大和动物调运日益频繁，布病疫情出现由北向南蔓延的趋势。同时，我国人布病感染人数也日趋严重，成为主要的公共卫生问题之一。
[0003]世界范围内流行的布鲁氏菌共有11个种，在我国最常见的种是牛种布鲁氏菌(B.abortμs)、羊种布鲁氏菌(B.meLitensis)、猪种布鲁氏菌(B.sμis)和犬种布鲁氏菌(B.canis)，其中牛种、羊种、猪种布鲁氏菌的菌体最外层含有脂多糖(LipopoLysaccharides，LPS)，也称为光滑型布鲁氏菌。LPS是光滑型布鲁氏菌的主要致病因子和抗原表位，也是最常用的血清学诊断抗原。而犬种布鲁氏菌缺乏LPS抗原，被称为粗糙型布鲁氏菌，因而，犬布病的诊断与其他动物的布病诊断方法有本质的区别。我国当前，牛种、羊种布鲁氏菌引起的布病发病率最高，地理分布最为广泛，因此，针对光滑型布鲁氏菌检测方法的研究最受重视。
[0004]在光滑型布鲁氏菌导致的布病诊断上，最常用的是血清学方法，包括虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光偏振试验(FPA)和免疫层析技术(ICA)等。虽然血清学方法使用范围广，能迅速识别阳性动物，但是血清学方法不能识别致病因子和风险点，都是在动物和人感染后才发现，所以血清学检测有滞后性。病原学检测因为能识别致病因子和传染源，在阻止布病向人和动物传播上具有不可替代的作用。但是，相对于血清学检测方法，布病的病原学检测方法较匮乏。目前使用的方法只有两个，一个是病原分离鉴定，另一个是实时荧光定量PCR(Qμantitative ReaL
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time PCR,qPCR)。病原分离鉴定需要进行细菌培养，费时费力，工作人员有感染的风险，所以必须在生物安全三级实验室内(BSL
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3)进行，极大限制了该方法的应用。实时荧光定量PCR方法虽然敏感，但操作起来需要严格的实验室条件和昂贵的仪器设备，须具有专业背景的人员才能胜任。布病是接触传播的传染病，感染母畜的流产物中含有大量病原菌，是最重要的传染源。在实践中，及时识别流产物中是否含有布鲁氏菌并及时清理消毒，可以有效降低布病传播。显然，病原分离鉴定和qPCR都无法实现快速检测的目的。因此，急需一个操作方便、快捷且能在现场使用的布病病原学诊断技术，以弥补现有技术的不足。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种布鲁氏菌诊断方法，用于现场、快速检测牛种、羊种和猪种布鲁氏菌，从而弥补现有技术的不足。
[0006]本专利技术首先提供一种用于制备单克隆抗体的杂交瘤细胞株LPS
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6B5(Hybridoma cell line LPS
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6B5)，于2023年2月15日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202341；
[0007]本专利技术所提供的杂交瘤细胞株LPS
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6B5用于制备能够检测布鲁氏菌的单克隆抗体；
[0008]本专利技术再一个方面提供一种IgY抗体，所述的IgY抗体是使用布鲁氏菌脂多糖(LPS)作为抗原来制备的；
[0009]所述的布鲁氏菌脂多糖LPS，其将布鲁氏菌A19疫苗株使用苯酚水溶液进行处理后，离心回收底层的苯酚相溶液制备的；
[0010]本专利技术所提供的单克隆抗体和IgY抗体用于制备能够检测布鲁氏菌的制品；
[0011]所述的制品，作为实施例的具体记载，为胶体金免疫层析试纸条，是将杂交瘤细胞株LPS
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6B5制备的单克隆抗体固定于醋酸纤维素膜上，将IgY抗体用胶体金标记后制备金垫，然后再组装成胶体金试纸条。
[0012]本专利技术所提供的布鲁氏菌免胶体金试纸条不与其他牛羊常见致病菌(如大肠杆菌、沙门氏菌、人苍白杆菌、单增李斯特菌、小肠耶尔森菌)发生交叉反应，从而保证了检测的特异性。敏感性试验结果显示，本专利技术试纸条对牛种布鲁氏菌的最低检测限可达1000CFμ。临床样品中，对流产物和羊水的检测效果最好，能够快速锁定排菌动物，降低布鲁氏菌传播风险。
附图说明
[0013]图1.提纯的LPS的SDS
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PAGE电泳和银染结果图，
[0014]图2.单克隆抗体SDS
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PAGE电泳结果图，其中泳道1
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4分别为纯化后的单克隆抗体LPS
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6B3、LPS
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6B4、LPS
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6B5、LPS
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6B6；N为纯化前的腹水；M为蛋白质分子量标准；图中的箭头所指为单抗的重链和轻链。
[0015]图3.LPS抗原免疫鸡后血清IgY抗体效价图，
[0016]图4.LPS抗原免疫鸡后蛋黄中IgY抗体效价图，
[0017]图5.鸡蛋黄中提纯的IgY抗体SDS
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PAGE电泳结果图，其中泳道1：免疫42天后纯化的卵黄IgY；2
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3：免疫28天后纯化的卵黄IgY；4：免疫14天后纯化的卵黄IgY；M：为蛋白质分子量标准；红色箭头所指为单抗的重链和轻链。
[0018]图6.不同LPS单抗在布鲁氏菌免疫层析检测中的效果对比图，
[0019]图7.LPS
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6B5和IgY制备的胶体金试纸条的敏感性检测结果图，其中左图为牛种布鲁氏菌DT株检测结果，右图为羊种布鲁氏菌XJ
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18菌株的检测结果；菌液的含菌量为1
×
107CFU/mL，10μL加样量表示含105CFU细菌。
[0020]图8.LPS
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6B5和IgY制备的胶体金试纸条对牛种布鲁氏菌检测的极限值确定图，
[0021]图9.手持式读卡器对检测结果的读取和标准曲线的绘制图，
[0022]图10.高含菌量羊水样品(Ct值为27)的胶体金试纸条检测结果图，
[0023]图11.低含菌量羊水样品(Ct值>30)的胶体金试纸条检测结果图。
具体实施方式
[0024]本专利技术筛选了一种能够制备针对光滑型布鲁氏菌脂多糖(LPS)抗原的单克隆杂交瘤细胞，并结合脂多糖(LPS)作为抗原制备的卵黄抗体IgY来建立依据双抗体夹心法原理建立的胶体金试纸条，用于现场快速检测光滑型布鲁氏菌(羊种、牛种、猪种)。实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202341。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株是使用布鲁氏菌脂多糖LPS作为抗原免疫小鼠制备的。3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备单克隆抗体中的应用。4.一种IgY抗体，其特征在于，所述的IgY抗体是使用布鲁氏菌脂多糖LPS作为抗原来制备的。5.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求4所述的IgY抗体，其特征在于，所述的布鲁氏菌脂多糖LPS，其将布鲁氏菌A19疫苗株使用苯酚水溶液进行处理后，离心回收底层的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金鹏，焉鑫，孙明军，杨向东，孙淑芳，樊晓旭，殷德辉，南文龙，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：