一种无致病性产蛋白酶的葡萄球菌筛选及酶活条件优化制造技术

本发明专利技术公开了一种无致病性产蛋白酶的葡萄球菌筛选及酶活条件优化，该菌保藏在武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20221556，保藏日期为2022年10月10日。从醋醅中分离筛选出一株产酸葡萄球菌，对其形态、生长特性，以及酶学活性进行了探究。结果表明该菌为葡萄球菌，无致病性，可产蛋白酶和脂肪酶。菌株最佳产酶条件为：温度31℃，接种量2.5％，培养时间34.4h，在此条件下测定蛋白酶活性为36.07U/g，优化前蛋白酶活力为24.20U/g，与优化前相比蛋白酶活力提高了49.04％。白酶活力提高了49.04％。白酶活力提高了49.04％。

【技术实现步骤摘要】
一种无致病性产蛋白酶的葡萄球菌筛选及酶活条件优化


[0001]本专利技术涉及微生物发酵
，更具体地说，它涉及到一种无致病性产蛋白酶的葡萄球菌(Staphylococcus)D
‑
6的筛选及酶活条件优化。

技术介绍

[0002]醋是一种发酵的酸味液态调味品，多由糯米、高粱、大米、玉米、小麦以及糖类和酒类发酵制成。不仅能增添食物的风味，提供人体所必需的氨基酸，还含有丰富的多酚、黄酮等物质，在抗癌、心血管疾病的预防方面有很大作用。在日常生活中不可或缺。
[0003]葡萄球菌多存在于发酵制品中，在香肠发酵过程中，能促进蛋白质和脂肪的降解，赋予香肠好的风味，对色泽稳定也起着重要作用。目前，已经有研究显示，葡萄球菌在镇江香醋醋醅中存在，它可在食物发酵的过程中产生独特的风味物质，赋予食醋丰富的口感和香气，且首次从醋醅中获得了葡萄球菌纯培养物。
[0004]蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，在醋醅发酵过程中，蛋白酶能将蛋白质分解为多肽和氨基酸，增加发酵醪中的氮，促进酵母生长繁殖，提升酒精速率，最终提高醋的酸度。在分解原料蛋白质的同时，蛋白酶在提高淀粉的利用率、酒精发酵力、产品中氨基酸态氮方面均起着重要作用。脂肪酶是类酯化合物分解、合成和酯交换的催化剂，在醋生产过程中能利用脂肪酶催化的醇解和醋化反应增加和改进食品的风味和香味。目前对传统食醋微生物的研究多聚焦在乳酸菌和醋酸菌，忽略了葡萄球菌的影响。葡萄球菌作为发酵香肠的主要微生物，在同为发酵产品的醋中也一定发挥了它独特的作用。
[0005]专利CN201210550667.X提供了一种高产蛋白酶地衣芽孢杆菌的筛选方法，筛选过程采用混合筛选，具有效率高、时间周期短等优点。专利CN202210538919提供了一株产蛋白酶的蜡样芽胞杆菌，在白酒大曲、食醋醋曲中具有良好的应用潜力。另有专利CN202210158566提供了一株高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，将其作为酿造功能菌应用于固态食醋酿造，可降低食醋生产成本，提升食醋的风味。然而上述现有技术均未提及葡萄球菌，且均未提及产蛋白酶菌株的发酵条件优化方面的工作。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是从醋醅中筛选出无致病性且同时兼具产酶活性的葡萄球菌，研究菌株相关特性，对菌株产蛋白酶条件进行优化，提高菌株蛋白酶产量，为之后醋的风味改良提供思路，对探究醋醅中产酸菌株、提升食醋风味具有积极作用。本专利技术的技术目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种无致病性产蛋白酶的葡萄球菌(Staphylococcus)D
‑
6，其特征在于，所述葡萄球菌D
‑
6保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 20221556。
[0008]进一步的，所述葡萄球菌D
‑
6的最适生长条件为：培养温度37℃，pH 5.5，酒精浓度0.05％，葡萄糖浓度3％。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供该葡萄球菌D
‑
6的筛选方法，包括下述步骤：
[0010]1)初筛
[0011]称取10g新鲜醋醅，于研钵中碾碎后加入到90mL的生理盐水中，37℃、180r/min恒温摇床培养2h，得到菌体悬浮液；吸取1％菌体悬浮液于富集培养基中培养12h，将通过富集培养的菌液用无菌生理盐水进行稀释得到10
‑1‑
10
‑6的稀释菌液，选取10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释度的稀释菌液，分别以移液枪吸取100μL均匀涂布于分离培养基上，并于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h；
[0012]2)复筛
[0013]挑取平板上产生透明圈的单个菌落通过平板划线方式再次进行分离纯化，即挑取平板上产生透明圈的菌落划线在分离培养基上，并于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h，重复以上操作3次，直至得到有明显透明圈的单个菌落；
[0014]其中，步骤1)中富集培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、葡萄糖30g/L、乙醇3.5％(V/V)；121℃，灭菌20min；
[0015]步骤1)和步骤2)中分离培养基：蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、碳酸钙5g/L、葡萄糖30g/L、乙醇5％(V/V)、琼脂粉20g/L；121℃，灭菌20min。
[0016]本专利技术的第三个目的是对筛选得到的葡萄球菌D
‑
6产蛋白酶的酶活性进行优化：
[0017]所述葡萄球菌D
‑
6发酵产蛋白酶的发酵条件为：发酵温度25
‑
37℃，接种量1
‑
4％，培养时间16
‑
40h；
[0018]优选的，所述葡萄球菌D
‑
6发酵产蛋白酶的发酵条件为：温度31℃，接种量2.5％，培养时间34.4h。
[0019]本专利技术的第四个目的是提供该葡萄球菌D
‑
6在食醋发酵生产中的应用。
[0020]所述葡萄球菌以2％的接种量接种于食醋固态发酵培养基中，于最适生长条件下进行发酵培养5d，测定培养基中pH、总酸和氨态氮的含量。固态发酵后pH减小，总酸含量增大，氨态氮含量增大。
[0021]其中，食醋固态发酵培养基(SSFM)：30g麸皮，10g稻壳置于500ml锥形瓶中，121℃灭菌20min。
[0022]保藏说明资料：
[0023]保藏中心登记入册编号：CCTCC No.M 20221556
[0024]保藏地址：中国.武汉.武汉大学
[0025]保藏日期：2022年10月10日
[0026]菌种名称：葡萄球菌
[0027]拉丁名：Staphylococcus
[0028]菌株编号：D
‑6[0029]保藏机构：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
[0030]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0031]1)本专利技术从醋醅中筛选获得一株葡萄球菌D
‑
6，为食醋酿造行业提供了新的酶源及有益微生物发酵菌株，从而达到提升食醋产品质量，改善食醋风味的目的；
[0032]2)该葡萄球菌D
‑
6无致病性，不会对生物体造成有害影响；
[0033]3)通过对该葡萄球菌D
‑
6产蛋白酶发酵条件进行优化，结果表明，最佳发酵条件
为：温度31℃，接种量2.5％，培养时间34.4h，在此条件下菌株摇瓶发酵蛋白酶活性为36.07U/g，而优化前蛋白酶活力为24.20U/g，与优化前相比蛋白酶活力提升了49.04％；
[0034]4)本专利技术通过微生物发酵法获得产酶无致病性的葡萄球菌的一种方法，具有安全、经济、绿色、可持续等特点；
[0035]5)该葡萄球菌D
‑
6可产蛋白酶和脂肪酶，分解食醋中蛋白质和脂肪，使之本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无致病性产蛋白酶的葡萄球菌(Staphylococcus)D
‑
6，其特征在于，所述葡萄球菌D
‑
6保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 20221556，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。2.根据权利要求1所述无致病性产蛋白酶的葡萄球菌(Staphylococcus)D
‑
6，其特征在于，所述葡萄球菌D
‑
6的最适生长条件为：培养温度37℃，pH 5.5，酒精浓度0.05％，葡萄糖浓度3％。3.根据权利要求1所述无致病性产蛋白酶的葡萄球菌(Staphylococcus)D
‑
6，其特征在于，所述葡萄球菌的筛选包括以下步骤：1)初筛称取10g新鲜醋醅，于研钵中碾碎后加入到90mL的生理盐水中，37℃、1g0r/min恒温摇床培养2h，得到菌体悬浮液；吸取1％菌体悬浮液于富集培养基中培养12h，将通过富集培养的菌液用无菌生理盐水进行稀释得到10
‑1‑
10
‑6的稀释菌液，选取10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释度的稀释菌液，分别以移液枪吸取100μL均匀涂布于分离培养基上，并于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h；2)复筛挑取平板上...

【专利技术属性】
技术研发人员：童文华，王书琴，李依芸，陈观莹，刘兴艳，徐浩然，胡吉祥，王辉，乔磊，罗惠波，
申请(专利权)人：四川轻化工大学，
类型：发明
国别省市：