一种结合电泳与质谱技术的水解蛋白奶粉过敏原检测方法技术

本发明专利技术涉及一种电泳结合液相质谱联用分析的水解奶粉中过敏原的检测方法，该检测方法呈现出的电泳结果首先能直观地观察到奶粉样品中蛋白质组成成分以及分子量的分布区间，初步判断其过敏原残留情况；然后将奶粉样品进行前处理，经LC

【技术实现步骤摘要】
一种结合电泳与质谱技术的水解蛋白奶粉过敏原检测方法


[0001]本专利技术涉及食品检测领域，具体涉及一种水解蛋白奶粉过敏原检测方法。

技术介绍

[0002]牛乳蛋白是牛奶中多种蛋白质总称，主要由酪蛋白和乳清蛋白两大部分组成。母乳中不含αS
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酪蛋白和β
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乳球蛋白，而在牛乳中αS
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酪蛋白和β
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乳球蛋白含量较高，这两种蛋白质是目前公认的过敏原。在正常情况下，这两种蛋白质能被人体消化吸收，但如果人体(特别是婴儿)的消化能力不足，这两种蛋白质以未被消化的形式进入人体，就会引起过敏反应。常见的过敏症状如湿疹、过敏性鼻炎、哮喘等。
[0003]科学家们通过大量研究发现，经过特有的水解技术，把牛奶大分子蛋白质变成短的片段后，可大大降低牛奶的致敏性。目前市场上的水解方法及水解程度各不相同，仍然会存在水解配方奶粉中含有抗原表位从而引发过敏的现象，因此亟待建立一种检测方法使严重过敏人群避免与牛乳过敏原的接触。
[0004]液相色谱
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质谱联用法(LC
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MS)是近年发展迅速的一种分析方法，该方法是以液相色谱为分离系统，以质谱作为检测系统。样品经过分离、离子化后，再通过质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经过检测器的得到质谱图，该方法具有很高的灵敏度、特异性、重现性、回收率等特点。目前暂未见电泳结合液相质谱联用技术检测水解蛋白奶粉过敏原的相关研究报道，通过两种技术的联合可有效识别与鉴定水解蛋白粉中过敏原。<br/>
技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供水解奶粉过敏原检测方法。针对上述专利技术目的，本专利技术第一方面提供一种水解蛋白奶粉过敏原检测方法，该检测方法包括如下步骤：
[0006](1)用分离胶和浓缩胶对奶粉样品进行电泳分析，电泳结束后用考马斯亮蓝染色，再用脱色液进行脱色，然后在凝胶成像仪中照胶成像；
[0007](2)将水解奶粉样品溶于水中混匀，超声溶解，离心后取出下层液体，过滤；
[0008](3)将过滤后的滤液样品超滤，取超滤后的液体旋转蒸发，用复溶试剂复溶，将复溶后的液体在液相质谱联用仪中进行分析；
[0009](4)将液相质谱联用仪得到的数据导入到Proteinpilot软件中，并以UniprotKB中的牛奶蛋白为库，对肽段进行搜索鉴定，筛选出响应高、可信度&gt;80％的肽段；
[0010](5)总结已有报道中主要牛乳过敏原蛋白的抗原表位氨基酸序列，将步骤(4)筛选到的肽段与总结的过敏原抗原表位逐一比对，计算出二者的氨基酸重叠个数以及重复率。
[0011]优选的，所述步骤(1)中用15％分离胶和5％浓缩胶对奶粉样品进行电泳分析，上样量为15μL，在80V条件下进行电泳分离30min后，调整电压至120V，继续分离100min；电泳结束后用考马斯亮蓝染色2h，再用脱色液进行脱色，每1h更换一次脱色液，共脱色3次，最后在凝胶成像仪中照胶成像。
[0012]优选的，所述步骤(2)中准确称量10mg水解奶粉样品，将其溶于1mL质谱水中，涡旋
混匀2min，直到无明显大颗粒，随后超声10min。
[0013]优选的，所述步骤(2)中超声后溶液的离心条件为在4℃，12000g条件下离心10min。
[0014]优选的，所述步骤(2)中过滤条件为过0.22μm滤膜，除去大分子量的杂质、未溶解的奶粉和未除尽的脂肪颗粒。
[0015]优选的，所述步骤(3)中将过滤后的样品转移至10kDa超滤离心管中，12000g离心10min，去除大分子量蛋白。
[0016]优选的，所述步骤(3)中取超滤后的液体200μL，在30℃的旋转蒸发仪中旋干2h。
[0017]优选的，所述步骤(3)中用100μL的2％乙腈和0.1％甲酸的水溶液复溶，涡旋混匀后，将液体转移至液相小瓶，放入样品盘进行液相质谱联用分析。
[0018]优选的，步骤(3)中液相质谱联用仪的液相条件如下：
[0019]日本岛津NexeraX2型液相色谱仪，PeptideBEHC18色谱柱(3.5μm，4.6mm
×
150mm)，流动相A为2％乙腈和0.1％甲酸的水溶液，流动相B为2％水和0.1％甲酸的乙腈溶液；柱温为40℃，流速为0.25mL/min；进样体积为10μL；流动相梯度洗脱程序见下表：
[0020][0021][0022]优选的，步骤(3)中液相质谱联用仪的质谱条件如下：
[0023]使用TripleTOF6600高分辨质谱，选择信息相关性采集(IDA)扫描，正电离模式；离子源气体1(GS1)：55psi；离子源气体2(GS2)：55psi；气帘气：25psi；去簇电压(DP)：80V；前体离子扫描m/z：350
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1500；前体离子扫描累积时间：0.25s；子离子扫描m/z：100
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1500；子离子扫描IDA数：20；子离子扫描累积时间：0.08s；滚动碰撞能量(CE)：启用。
[0024]优选的，所述步骤(4)中对肽段进行搜索鉴定的参数设置为：SampleType：Identification；CysAlkylation：Iodoacetamide；Digestion：None；SearchEffort：RapidID；IDFocus：Biologicalmodifications。
[0025]优选的，所述步骤(4)中对肽段进行搜索鉴定时，选择的过敏原蛋白种类选自α
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乳白蛋白、β
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乳球蛋白、αS1
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酪蛋白、αS2
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酪蛋白、β
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酪蛋白和κ
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酪蛋白中的一种或多种。
[0026]更优选的，所述步骤(4)中对肽段进行搜索鉴定时，选择的过敏原蛋白种类为α
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乳白蛋白、β
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乳球蛋白、αS1
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酪蛋白、αS2
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酪蛋白、β
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酪蛋白和κ
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酪蛋白。
[0027]进一步优选的，所述步骤(4)中对肽段进行搜索鉴定时，选择的过敏原蛋白种类为β
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乳球蛋白、β
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酪蛋白和κ
‑
酪蛋白。
[0028]优选的，所述步骤(5)中抗原表位氨基酸序列选自下述序列中的一种或多种：
[0029]α
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乳白蛋白抗原表位1：EQLTKCEVFRELKDLK(SEQ ID NO.1)；
[0030]α
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乳白蛋白抗原表位2：KDLKGYGGVSLPEW(SEQ ID NO.2)；
[0031]α
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乳白蛋白抗原表位3：STEYGLFQINNK(SEQ ID NO.3)；
[0032]α
‑
乳白蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水解蛋白奶粉过敏原的检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：(1)用分离胶和浓缩胶对奶粉样品进行电泳分析，电泳结束后用考马斯亮蓝染色，再用脱色液进行脱色，然后在凝胶成像仪中照胶成像；(2)将水解奶粉样品溶于水中混匀，超声溶解，离心后取出下层液体，过滤；(3)将过滤后的滤液样品超滤，取超滤后的液体旋转蒸发，用复溶试剂复溶，将复溶后的液体在液相质谱联用仪中进行分析；(4)将液相质谱联用仪得到的数据导入到Proteinpilot软件中，并以UniprotKB中的牛奶蛋白为库，对肽段进行搜索鉴定，筛选出响应高、可信度&gt;80％的肽段；(5)总结已有报道中主要牛乳过敏原蛋白的抗原表位氨基酸序列，将步骤(4)筛选到的肽段与总结的过敏原抗原表位逐一比对，计算出二者的氨基酸重叠个数以及重复率。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中用15％分离胶和5％浓缩胶对奶粉样品进行电泳分析，上样量为15μL，在80V条件下进行电泳分离30min后，调整电压至120V，继续分离100min；电泳结束后用考马斯亮蓝染色2h，再用脱色液进行脱色，每1h更换一次脱色液，共脱色3次，最后在凝胶成像仪中照胶成像。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中过滤条件为过0.22μm滤膜，除去大分子量的杂质、未溶解的奶粉和未除尽的脂肪颗粒。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中取超滤后的液体200μL，在30℃的旋转蒸发仪中旋干2h。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中用100μL的2％乙腈和0.1％甲酸的水溶液复溶，涡旋混匀后，将液体转移至液相小瓶，放入样品盘进行液相质谱联用分析。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中液相质谱联用仪的液相条件如下：日本岛津Nexera X2型液相色谱仪，Peptide BEH C18色谱柱(3.5μm，4.6mm
×
150mm)，流动相A为2％乙腈和0.1％甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：于宁，陈颖，张凤霞，张九凯，杨艳，周兴兵，袁庆彬，康文瀚，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：