一种M2型巨噬细胞外泌体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种M2型巨噬细胞外泌体及其应用，其中，所述M2型巨噬细胞外泌体由M2型骨髓巨噬细胞分泌获得，所述M2型巨噬细胞外泌体通过激活PI3K/AKT信号通路诱导巨噬细胞由M1型向M2型重编程，所述M2型巨噬细胞外泌体提高糖尿病骨免疫微环境中M2型巨噬细胞的比例，从而有效促进糖尿病骨愈合。从而有效促进糖尿病骨愈合。从而有效促进糖尿病骨愈合。

【技术实现步骤摘要】
一种M2型巨噬细胞外泌体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种外泌体及其应用，特别涉及一种M2型巨噬细胞外泌体及其应用。

技术介绍

[0002]根据世界卫生组织的数据，目前有超过4.22亿人患糖尿病(Diabetes mellitus，DM)，其中2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus，T2DM)占90％。DM是一种常见的肥胖疾病，它是由胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍引起的以血糖水平升高为特征的慢性代谢性疾病。糖尿病由于其持续高血糖状态容易导致多种并发症，尤其对人体骨骼系统造成严重负面影响。研究表明，糖尿病人群往往伴随骨折愈合延迟，给患者的身体健康和生活质量带来沉重的负担。
[0003]近年来，巨噬细胞极化在骨折愈合中的重要作用逐渐引起人们的重视。巨噬细胞源自单核细胞，根据其诱导极化可分为：经典激活巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和交替激活巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。M1、M2型巨噬细胞在骨折愈合的4个阶段分别发挥促炎和抑炎作用，其不同亚型分泌不同细胞因子调节成骨细胞及破骨细胞分化。骨折愈合急性炎症期，大量炎症因子聚集，此时募集到骨折部位的巨噬细胞具有高度可塑性，在炎症环境刺激下可极化为M1型巨噬细胞，同时分泌大量促炎相关因子如肿瘤坏死因子
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α(TNF
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α)、白细胞介素
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6(IL
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6)、IL
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12和IL
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1β，放大炎症级联反应，并诱导破骨细胞生成完成骨吸收，协助骨折部位清除坏死组织。尽管炎症反应已被证明对正常愈合至关重要，但持续或不消退的炎症会抑制骨折愈合。因此，合理调控巨噬细胞的促炎反应对于骨折愈合具有深远意义。
[0004]外泌体是直径在50～150nm左右的微囊泡，参与细胞因子、mRNAs、miRNAs和蛋白质等生物化学物质的运输。因其免疫原性极低，并具有优良循环稳定性和生物相容性的特点而广泛应用于研究。此外，外泌体是细胞通讯间的重要调节者，其具有较高的生物屏障穿透与细胞摄取能力。因此，外泌体在调控细胞特性与行为方面拥有巨大的潜力。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术无法改变巨噬细胞的极化方向以及巨噬细胞的极化失衡，提供一种M2型巨噬细胞外泌体及其应用，通过该M2型巨噬细胞诱导M1重编程为M2，以此提高M2型巨噬细胞比例则可有效促进DM骨愈合。
[0006]为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种M2型巨噬细胞外泌体，所述M2型巨噬细胞外泌体由M2型骨髓巨噬细胞分泌获得，所述M2型巨噬细胞外泌体通过激活PI3K/AKT信号通路诱导巨噬细胞由M1型向M2型重编程。
[0007]通过大量实验以及研究，本案专利技术人发现：骨创伤微环境随骨折愈合不同阶段不断变化，巨噬细胞通过表面受体来监测和响应局部微环境信号，切换功能表型，以适应骨愈合需要。而M1型巨噬细胞在辅助型T细胞2(Th2)相关细胞因子如IL
‑
4和IL
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13激活下极化为M2型巨噬细胞，将促炎信号转变为抗炎信号。在抗炎反馈机制中，M2型巨噬细胞分泌IL
‑
10、
精氨酸酶
‑
1(Arg
‑
1)和趋化因子(C
‑
C基序)配体17(CCL
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17)等细胞因子在组织创伤愈合中发挥抑炎作用。M2型巨噬细胞还通过调节抑瘤素M(OSM)和骨形态发生蛋白
‑
2(BMP
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2)促进BMSCs向软骨和成骨分化，促进软骨痂形成。在骨折愈合后期，M2型巨噬细胞仍占主导地位，其原因在于M2型巨噬细胞分泌生长因子直接或间接导致骨基质矿化增加，加速硬骨痂形成，促进骨折愈合。
[0008]因此，在DM骨微环境中，巨噬细胞极化失衡，M1型巨噬细胞增多，M2型巨噬细胞减少，若改变巨噬细胞极化方向，提高M2型巨噬细胞比例则可有效促进DM骨愈合。
[0009]基于上述，本案专利技术人通过获得本案所述的M2型巨噬细胞外泌体，以此适当干预巨噬细胞向M2型极化，进而有利于促进DM骨折愈合。
[0010]优选地，所述M2型巨噬细胞外泌体的获得过程如下：
[0011]分离并培养4～6周C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓巨噬细胞，使用20ng/mL IL
‑
4、10％FBS和1％青链霉素的H
‑
DMEM完全培养基诱导72小时为M2型巨噬细胞；
[0012]收集无外泌体血清完全培养基孵育24～72小时后的M2型骨髓巨噬细胞上清液，所述的无外泌体血清完全培养基为H
‑
DMEM基础培养基中添加10％无外泌体血清和1％青链霉素；
[0013]对M2型骨髓巨噬细胞上清液进行离心，离心条件为：300
×
g离心10分钟，2000
×
g离心10分钟，4℃下10000
×
g离心30分钟，得到离心后的上清液；
[0014]用0.22μm过滤器过滤上清液，去除细胞和碎片，收集过滤后的上清液；
[0015]将过滤后的上清液在110000
×
g离心70分钟后，在PBS中重悬，再在110000
×
g离心70分钟，获得所述M2型巨噬细胞外泌体。
[0016]第二方面，本专利技术提供了一种上述的M2型巨噬细胞外泌体在加速骨愈合上的应用。
[0017]优选地，所述骨愈合为糖尿病骨愈合。
[0018]优选地，所述糖尿病为2型糖尿病。
[0019]第三方面，本专利技术提供了一种上述的M2型巨噬细胞外泌体在促进巨噬细胞发生重编程上的应用。
[0020]优选地，所述重编程通过M2型巨噬细胞外泌体激活PI3K/AKT信号通路诱导巨噬细胞由M1型向M2型重编程。
[0021]第四方面，本专利技术提供了一种促进骨折愈合的药物，所述药物的有效成分为上述M2型巨噬细胞外泌体。
[0022]优选地，促进骨折愈合的药物的使用时间为骨折愈合急性炎症期。
[0023]优选地，所述的促进骨折愈合的药物的使用方式为局部注射。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有如下所述的优点以及有益效果：
[0025]1.M2型巨噬细胞分泌的外泌体可以诱导M1型巨噬细胞重编程为M2型巨噬细胞
[0026]2.M2型巨噬细胞分泌的外泌体通过激活PI3K/AKT信号通路诱导M1型巨噬细胞重编程为M2型巨噬细胞。
[0027]3.M2型巨噬细胞分泌的外泌体明显加速糖尿病骨折愈合。
附图说明
[0028]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0029]图1为M2型巨噬细胞外泌体的制备图；
[0030]图2为M2型巨噬细胞外泌体形态电镜图；
[0031]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种M2型巨噬细胞外泌体，其特征在于，所述M2型巨噬细胞外泌体由M2型骨髓巨噬细胞分泌获得，所述M2型巨噬细胞外泌体通过激活PI3K/AKT信号通路诱导巨噬细胞由M1型向M2型重编程。2.根据权利要求1所述的M2型巨噬细胞外泌体，其获得过程如下：分离并培养4～6周C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓巨噬细胞，使用20ng/mL IL
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4、10％FBS和1％青链霉素的H
‑
DMEM完全培养基诱导72小时为M2型巨噬细胞；收集无外泌体血清完全培养基孵育24～72小时后的M2型骨髓巨噬细胞上清液，所述的无外泌体血清完全培养基为H
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DMEM基础培养基中添加10％无外泌体血清和1％青链霉素；对M2型骨髓巨噬细胞上清液进行离心，离心条件为：300
×
g离心10分钟，2000
×
g离心10分钟，4℃下10000
×
g离心30分钟，得到离心后的上清液；用0.22μm过滤器过滤上清液，去除细胞和碎片...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏佳灿，王一力，井莹莹，耿振，
申请(专利权)人：苏州禾麦医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：